Сканирующая ближнепольная и двухфотонная микроскопия нано- и биообъектов

• Автор: Астафьев, Артем Александрович
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Содержание
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1.1 Ближнепольная и двухфотонная сканирующая микроскопия

1.2 Ретинальный липофусцин и его роль в фотоокислительных процессах

в организме

1.3 Оптические свойства металлических наночастиц и нанокомпозитов

металл-ТЮ2

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ И А2Е

2.1 Экспериментальная установка: ближнепольная сканирующая

микроскопия
2.2 Результаты и обсуждение
2.3 Основные результаты
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НАНОКОМПОЗИТОВ Аи)-ТЮ2
3.1 Экспериментальная установка и приготовление образцов
3.2 Исследование «горячих точек» в металл-полу проводниковых
нанокомпоз итах
3.3 Эксперименты с рамановским рассеянием на молекулах красителя, адсорбированного на нанокомпозитах металл-ТЮг
3.4 Основные результаты
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение.
Возможность детектирования и изучения малых объектов чрезвычайно важна для многих научных дисциплин, включая биологические науки и пауки о материалах. Для этих целей традиционно использовались различные методы оптической микроскопии. Однако во многих случаях пространственное разрешение оптических микроскопов оказывается недостаточным для детектирования субмикронных объектов. Кроме того, существует теоретический предел пространственного разрешения оптических микроскопов (дифракционный предел), который связан с невозможностью сфокусировать излучение в пятно с диаметром, меньшим примерно половины длины волны используемого светового источника. Для видимого диапазона этот предел составляет около 200-300 нм, что является недостаточным для многих приложений. В последние годы получили интенсивное развитие две новых методики сканирующей оптической микроскопии, позволяющих получать изображения с высоким пространственным разрешением и контрастностью. Первая методика, которая называется сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля, использует для построения изображения, сильно локализованные затухающие электромагнитные поля (называемые также ближним полем), возникающие при прохождении излучения через апертуру оптического зонда, имеющую субдлиноволновый размер. Пространственное разрешение при этом определяется диаметром апертуры зонда, причём изготовление апертур с диаметром в сотни и десятки нанометров представляет собой чисто технологическую задачу. Несмотря на некоторую сложность реализации ближнепольная микроскопия позволяет получать пространственное разрешение, лежащее ниже дифракционного предела.
Вторая методика - это сканирующая многофотонная флуоресцентная микроскопия, развитие которой тесно связано с использованием лазерных импульсов фемтосекундной длительности. Благодаря малому времени импульса можно эффективно осуществить многофотонное поглощение при незначительной энергии светового импульса. Это позволяет избавиться от нежелательного фона и увеличить контрастность изображения. Пространственное разрешение многофотонной флуоресцентной микроскопии приближается к дифракционному пределу разрешения. Данная работа посвящена разработке и применению этих методик для изучения двух объектов.
Первым из изучаемых объектов были липофусциновые гранулы (ЛГ) из ретинального пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека. Это структуры микронного размера, накапливающиеся в клетках РПЭ с возрастом, представляют собой, по существу, недопереваренные лизосомальными ферментами фрагменты наружных сегментов палочек и колбочек сетчатки. Помимо остатков белков и липидов ЛГ содержат более десятка флуорофоров и фотосенсибилизаторов, которые, скорее всего, являются продуктами переваривания ретиналя, высвобождающегося из молекулы зрительного пигмента в результате её фотолиза. Установлена химическая природа только двух флуорофоров - эго бис-ретинилиден этаноламин (А2Е)[1] и димер ретиналя с фософатидилэтаноамином[2]. Под действием видимого света липофусциновый гранулы образуют активные формы кислорода, которые в свою очередь способны повреждать белки, липиды, ДНК и инициировать апоптоз клеток РПЭ[3]. Обнаружена корреляция между накоплением в клетках РПЭ липофусциновых гранул и развитием дегенеративных заболеваний сетчатки. Причём свет способен оказывать усугубляющее воздействие на развитие этих заболеваний. Считается, что одним из основных источников

фототоксических свойств липофусцина является содержащиеся в нём жёлтые флуорофоры, в частности наиболее известный из них - А2Е, для которого известно, что он оказывает фототоксическое действие при облучении синим светом. Тем не менее, механизм фототоксического действия липофусцина остаётся не до конца понятным. Поэтому подробное исследование структуры, спектральных и фотохимических свойств липофусциновых гранул из клеток РПЭ является исключительно важным для понимания патогенеза, разработки мер профилактики и, возможно, способов лечения этих тяжелейших глазных заболеваний. Поскольку размер ЛГ составляет ~1 мкм, для изучения их ультраструктуры необходимо использовать методы микроскопии ближнего поля. Кроме того, для понимания механизма фототоксичности ретинального липофусцина необходимо изучения фотофизических свойств составляющих его флуорофоров и в частности А2Е.
Объектом исследования во второй части данной работы были нанокомпозиты, состоящие из нанокристаллов двуокиси титана, с фотокаталитически высаженными на их поверхность наночастицами золота и серебра (Рис.1).
Рис Л Схематическое изображение нанокомпозитных структур металл-ТЮг
Мезопористые пленки ТЮг благодаря высокой удельной поверхности являются перспективным объектом для применения в фотокатализе и фотовольтаических элементах[4]. В частности благодаря большой ширине запрещённой зоны ТЮг, образующиеся при поглощении полупроводником света электрон и дырка имеют потенциалы достаточные для разложения воды в топливных элементах. Однако эффективность фотокатализаторов на основе диоксида титана ограничена двумя факторами[5]. Во-первых, образование электрон-дырочной пары происходит только при поглощении квантов с энергией больше ширины запрещённой зоны ТЮг, равной примерно 3 эВ, что соответствует ближнему УФ-диапазону. Во-вторых, электрон и дырка, как правило, достаточно быстро рекомбинируют, не участвуя в окислительновосстановительных реакциях. Металлические наночастицы, депонированные на поверхность мезопористых пленок ТЮг, способны улучшить фотокатапитические свойства системы[6]. В зоне контакта металл-полупроводник создаётся контакт Шотки, электрическое поле которого способствует разделению образовавшихся в полупроводниковых наночастицах при поглощении света зарядов. Кроме того, металл может служить донором электронов, передавая электроны, возбужденные при поглощении света в зону проводимости ТЮг. В этом случае система металл-

наблюдали на поверхности металлических наночастиц, на поверхности
электрохимических электродов, на металлических дифракционных решетках и других неровных поверхностях. Усиление наблюдали для разных металлов, но набольшее усиление вызвало применение серебра.
Механизмы усиления комбинационного рассеяния.
Первоначально авторы открытия приписывали усиление увеличенной за свет неровностей площади поверхности, но дальнейшие исследования показали, что усиление вызывают металлические неровности, которые усиливают поле в следствии плазменного резонанса. В некоторых случаях усиление связывают с химическим механизмом [75].
Когда длина волны падающего излучения близка к длине на которой возбуждаются плазмонные колебания электронов электрическое поле вблизи поверхности металлической наночастицы может усиливаться в 103раз. Такое усиление падающего электромагнитного поля приводит к усилению сигнала комбинационного рассеяния в 106 -109раз. Этот механизм усиления называют электромагнитным, потому что он всецело обусловлен наличием резонанса между возбуждением плазмонов и падающего электромагнитного излучения.
Вторым фактором, который вносит вклад в усиление, является химический перенос электрона между молекулой и металлической поверхностью. Концепция химического механизма SERS была введена после того, как наблюдалась явная химическая селективность поверхностного усиления рамановского рассеяния. Например, СО демонстрирует в 50 раз более сильное усиление в сравнение с N2, несмотря на то, что при отсутствии поверхности сечения рамановского рассеяния для этих молекул практически идентичны [76]. В пользу существования химического механизма говорит ряд экспериментов, в которых при адсорбции возникали дополнительные энергетические уровни, на которые происходил перенос электрона. Возникновение такой способности к переносу заряда происходит не только при химической, но так же и при физической адсорбции. При химическом усилении происходит увеличение поляризуемости молекулы и в этом он схож с резонансным комбинационным рассеянием. Очень часто сложно отделить влияние электромагнитного от химического механизма, к тому же общий вклад химического механизма в общее усиление не более одного двух порядков.
Спектроскопия комбинационного рассеяния отдельных молекул
Сканирующая лазерная микроскопия дает новые возможности для исследования гигантского комбинационного рассеяния на уровне отдельных молекул. Хотя электромагнитный и химический механизм могут объяснить большинство экспериментальных данных, эти два механизма кажутся недостаточным и для объяснения сверх усиления комбинационного рассеяния, которое в некоторых случаях наблюдается для одиночных молекул. Одновременно несколько групп [77,78], стали свидетелями невероятно большого (усиление составляло 1015) сечения КР, для молекул красителя адсорбированного на 100 нм наночастицах серебра. Оказалось, что интенсивность КР флуктуирует во времени и, что только небольшая часть (~1%) адсорбированных молекул способна к генерации гигантского рамановского сигнала. Эти результаты говорят о том, что гигантское комбинационное рассеяние вызывается некими специфическими особенностями на поверхностях металлических наночастиц, притом эти особенности проявляются только для небольшой части наночастиц одинакового размера. Эти необычные наночастицы назвали «горячими» или активными наночастицами (или