Жидкостная хроматография в критических условиях в сочетании с масс-спектрометрией для изучения первичной структуры биомолекул

• Автор: Тарасова, Ирина Алексеевна
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Общая характеристика работы

1. Введение. Основные представления о предмете исследований

1.1 Масс-спектрометрия как основной метод исследования

биомолекул в протеомике

1.2 Модели предсказания хроматографических времен удерживания белков и пептидов по их

аминокислотной последовательности

1.3 Жидкостная хроматография в критических условиях как

метод исследования синтетических полимеров

2. Теоретические основы концепции жидкостной хроматографии в критических условиях

2.1 Модель случайных блужданий для гетерополимеров

2.2 Эффективная энергия взаимодействия биомакромолекулы с поверхностью твердой фазы в градиентной
хроматографии
2.3 Основное уравнение градиентной хроматографии
2.4 Система уравнений модели BioLCCC для определения
объемов/времен удерживания пептидов
3. Определение феноменологических параметров
4. Апробация модели на экспериментальных данных
4.1 Экспериментальные условия и методы исследования
4.2 Корреляция экспериментальных и предсказанных времен
удерживания на примере пептидных стандартов и дайджеста белков бактерии Escherichia Coli
4.3 Предсказание разделения пептидов с модифицированными аминокислотными остатками на примере изомеров лейцин и
изо лейцин
4.4 Предсказание разделения последовательностей с перестановкой аминокислот на примере пептидов с зеркально-симметричными текстами
4.5 Практическое применение модели BioLCCC для фильтрации и верификации результатов поиска по базам данных в процессе идентификации пептидов и белков на примере Escherichia Coli
Заключение и выводы
Список публикаций
Литература

Общая характеристика работы
Введение. Актуальность проблемы. В настоящее время задача определения первичной структуры белка, т. е. его аминокислотной последовательности, решается преимущественно методами тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). В первую очередь это связано с тем, что масс-спектрометрический метод секвенирования белков является самым быстрым из всех известных. В протеомных исследованиях для осуществления МС/МС секвенирования распространение получили масс-анализаторы типа квадрупольной радиочастотной ловушки, времяпролетные масс-спектрометры, спектрометры ионного циклотронного резонанса, а также совсем новый тип масс-анализатора, получивший название "орбитальная ионная ловушка" (orbitrap). Масс-спектрометрия добилась несомненных успехов в области исследования и идентификации структуры белков и пептидов, а также в решении других задач протеомики и биоинформатики. В то же время многие исследователи отмечают высокий процент ложных идентификаций пептидов, а, следовательно, и белков, если определение их аминокислотной последовательности проводится исключительно по масс-спектрометрическим данным. В связи с этим существует необходимость развития новых, отличных от масс-спектрометрии, методов определения и идентификации аминокислотных последовательностей. Естественным представляется использование для этих целей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Во-первых, перечисленные выше типы масс-спектрометров работают "в связке" с хроматографом, позволяющим разделять сложные смеси пептидов, образующихся в результате ферментативного гидролиза белков, и, тем самым, упростить их МС/МС анализ. Во-вторых, хроматографическое разделение основано на взаимодействии макромолекулы с поверхностью, и это взаимодействие также отражает характер чередования аминокислотных остатков в цепи. Однако до

Эта шкала энергий является основой для всех последующих расчетов.
Описанный выше алгоритм определения феноменологических параметров был применен нами к совокупности экспериментальных данных, описанных в работе [47]. Использованный в этой работе набор синтетических пептидов Ac- GXXLLLKK - amid, где X- аминокислотный остаток, позволяет из экспериментальных хроматографических данных по их разделению определить необходимую шкалу энергий Х°.
В расчетах по системе уравнений (13) необходимо задавать константы колонки Vg (объем подвижной фазы) и Vp (объем неподвижной фазы), а
также размер пор адсорбента D. Поскольку эти параметры в упомянутой выше работе [47] не определялись экспериментально, для них нами были
определены следующие величины: V0 ~Vp *0.9—^--/ = 1.5мл для колонки
размером 4.1 х 250 мм и F0« VP »1.7 мл для колонок 4.6 х 250 мм. Размер пор D, выраженный в единицах размера звена, был принят D = 30 для адсорбентов с порами 300 А и D = 10 для пор 100 А. Следует отметить, что выбранные таким образом параметры модели близки к реальным величинам, однако в целом эти параметры слабо влияют на общую картину разделения. Параметры растворителя еА= 0 и ев= 2.40 выбирались такими, чтобы совокупность экспериментально зафиксированных времен удерживания модельных пептидов при найденных величинах X0,. описывалась наилучшим образом.
Кроме эффективных энергий адсорбции аминокислотных остатков в рассмотрение необходимо включить также и энергии адсорбции концевых групп Х°N:C- Энергии концевых групп Ас- (CH3CO-NH-) и-amide (-CO-NH2) принимались равными нулю еАс_ = е |||И.(| = 0, что является достаточно естественным приближением для взаимодействия этих групп с обращенной фазой. Если пептиды имеют другие концевые группы, Я (H2N-NH) и -free acid (-СО-ОН), то их наличие меняет энергию адсорбции концевых