Разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов

• Автор: Полевая, Елена Валерьевна
• Шифр специальности: 14.04.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 182 с. : 25 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Сигнальные молекулы в развитии микробных популяций

1.1.1 Первые наблюдения

1.1.2 Автостимуляторы роста микроорганизмов

1.1.3 Автоингибиторы роста микроорганизмов

1.1.4 Авторегуляторы выживаемости бактерий

1.1.5 «Чувство кворума» у бактерий

1.1.6 Альтернативный вариант «чувства кворума»
1.1.7 Регуляция факторов патогенности неспецифическими сигнальными молекулами
1.2 Макроорганизм и его микрофлора, концепция суперорганизма
1.3 Метаболитные препараты
1.3.1 Принципы конструирования и основные свойства
1.3.2 Ингибирование систем «чувства кворума» - новый
подход к созданию препаратов против патогенности
бактерий
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Культуры бактерий
2.2 Культивирование чистых культур энтеробактерий
2.3 Культивирование смешанных культур энтеробактерий
2.4 Культивирование Ь. р1аШагит 8Р-АЗ и В. Ьфс1шп
2.5 Контроль роста культур бактерий
2.6 Расчет параметров кривой роста культур
2.7 Подготовка проб для хроматографического анализа
2.8 Анализ состава низкомолекулярных карбоновых кислот методом ВЭЖХ
2.9 Анализ состава аминокислот ВЭЖХ
2.10 Анализ состава экзометаболитов методом ГХ-МС
2.11 Определение биологической активности индивидуальных
экзометаболитов и их комплексов
2.11.1 Тест «инициация роста»

2.11.2 Скорость роста культур при высоких плотностях
засева
2.11.3 Периодическое культивирование в колбах на качалке
2.11.4 Рост колоний на агаризованной среде
2.11.5 Гемолиз эритроцитов
2.11.6 Амплификация фрагмента гена hlyA
2.11.7 Оценка уровня экспрессии гена hlyA
2.11.8 Секвенирование фрагмента гена hlyA
2.11.9 Антагонистическая активность E.coli VL613
2.11.10 Устойчивость E.coli VL613 к стрессовым воздействиям
2.12 Показатели качества капель и растворов для приема внутрь
2.12.1 Качественный анализ
2.12.2 Потенциометрическое определение pH
2.12.3 Удельная электрическая проводимость
2.12.4 Прозрачность капель для приема внутрь
2.12.5 Микробиологическая чистота
2.12.6 Специфическая активность
2.12.7 Количественное содержание солей карбоновых кислот
и аминокислот
2.1 Статистическая обработка результатов
Глава 3 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ
БАКТЕРИЙ
3.1 Состав экзометаболитов, выделяемых пятью штаммами бактерий семейства Enterobacteriacea, Bifidobacterium bifidum
и Lactobacillus plantarum 8P-A3
3.1.1 Экзометаболиты бактерий семейства Enterobacteri-acea
3.1.2 HKK В. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3
3.2 Биологическая активность внеклеточной среды и индивидуальных экзометаболитов
3.2.1 Действие внеклеточной среды на рост бактерий в стационарных условиях при низких плотностях засева (инициация роста)

3.2.2 Инициация роста экзометаболитами
3.2.3 Действие экзометаболитов на рост бактерий на агари-зованной среде
3.3 Изменение концентраций НКК в процессе роста бактерий
3.3.1 Зависимость состава и динамики НКК от способа выращивания посевного материала
3.3.2 Динамика НКК, выделяемых энтеробактериями
3.3.3 Динамика НКК, выделяемых В. bifidum 1 и L. plantarum 8Р-АЗ
3.4 Изменение концентраций аминокислот в процессе роста бактерий
3.4.1 Зависимость состава и динамики аминокислот от способа выращивания посевного материала
3.4.2 Динамика аминокислот
3.5 Изменение концентраций экзометаболитов в процессе роста смешанных культур бактерий
3.5.1 Смешанные культуры E.coli М-17 и 075; №14;
S.enteritidis
3.5.2 Сопоставление изменения численности бактерий и концентрации молочной кислоты
Глава 4 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ
4.1 Комплекс для подавления роста E.coli
4.2Биологическая активность комплекса для подавления роста
E.coli
4.2.1 Действие комплекса на рост бактерий в колбах на качалке
4.2.2 Действие комплекса на рост смешанной культуры
E.coli 075 и М
4.2.3 Влияние комплекса на синтез порообразующего токсина гемолизина
4.3 Комплекс для стимуляции роста E.coli VL613
4.4 Биологическая активность комплекса для стимуляции роста E.coli VL613

лентности, ответственных за деструкцию тканей организма-хозяина при инициировании инфекционного процесса: эластазы, протеазы, экзотоксина и щелочной фосфатазы. Эта система активирует также экспрессию генов второй QS-системы P. aeruginosa, Rhll/R, приводя к ее индукции. Комплекс белка RhlR с аутоиндуктором C4-HSL индуцирует экспрессию двух генов, регулируемых QS-системой первого типа. На основе этих механизмов были разработаны подходы, препятствующие связыванию АГЛ с рецепторными белками.
Первый подход заключается в химическом синтезе соединений - аналогов природных АГЛ сигналов [126]. Второй подход основывается на поиске природных соединений, которые имитируют АГЛы и блокируют рецепторы LuxR-типа. Третий подход заключается в использовании ферментов (например, лактоназ), которые способны разрушать АГЛы. Почвенные бактерии Bacillus sp. продуцируют лактоназу, которая гидролизует лактон-ное кольцо. Вероятно, этот фермент необходим Bacillus в соперничестве с другими почвенными бактериями [91, 126].
Ингибирование QS-систем грамположительных бактерий
Для грамположительных бактерий наиболее подробно изучены несколько систем, принимающих участие в контроле вирулентности Staphylococcus aureus, в регуляции компетентности (т.е. способности принимать экзогенную ДНК при трансформации) Streptococcus pneuminiae, регуляции компетентности и споруляции Bacillus subtilis. В качестве автоиндукторов QS-систем у грамположительных бактерий используются секретируемые пептиды (AIP).
Различные грамположительные бактерии синтезируют различные пептидные сигнальные молекулы. Сигнальный механизм функционирует через каскад фосфорилирование/дефосфорилирование. Сенсорная киназа фосфорилируется, после чего фосфорильная группа переносится на соответствующий белок - регулятор ответа. Фосфорилированный регулятор ответа связывается с ДНК и активирует транскрипцию гена-мишени [112,