Изучение нейропротективной активности рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в полимерные носители

• Автор: Солев, Игорь Николаевич
• Шифр специальности: 14.03.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Характеристика эритропоэтина

1.1.5 Механизмы нейропротекторного действия ЭПО

1.1.6 Препараты, созданные на основе молекулы эритропоэтина

1.2 Системы используемые для доставки лекарственных препаратов в

1.2. Г Характеристика поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц

1.2.2 Характеристики полилактидных наночастиц

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Препараты и вещества, используемые в исследовании

2.2 Животные используемые в исследовании
2.3 Методики получения и анализа наносомальных форм РЭЧ
2.3.1 Получение экспериментальной формы эритропоэтина ,
включенного в ПБЦА наночастицы
2.3.2 Получение экспериментальной формы эритропоэтина ,
включенного в ПЛГА наночастицы
2.3.3 Определение размеров наночастиц
2.3.4 Электронно-микроскопическое изучение формыи размеров наночастиц
2.3.5 Определение степени включения РЭЧ на наночастицы
2.4 Методика определения содержания РЭЧ в головном мозге крыс
2.4.1 Методика определения концентрации ЭПО' методом
иммуноферментного анализа
2.5: Моделирование гипоксических состояний
2.5.1 Моделирование гемической гипоксии
2.5.2 Моделирование гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме
2.5.3 Моделирование гипоксической гипобарической гипоксии
2.6 Модель и нтрацеребральной п осттравматической гематомы, геморрагического инсульта для изучения нейропротекторной активности веществ
2.6.1 Исследование неврологического дефицита по шкале Stroke-index McGrow
2.6.2 Методика приподнятого крестообразного лабиринта
2.6.3 Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности в открытом поле
2.6.4 Исследование нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня
2.6.5 Тест подтягивание на горизонтальной перекладине
2.6.6. Условный рефлекс пассивного избегания
2.6.7. Динамика веса животных
2.7. Методы исследования влияния РЭЧ на экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF in vitro
2.7.1 Получение первичной культуры клеток нейроглии
2.7.2 Выделение тотальной РНК из культуры клеток астроцитов
2.8 Методы исследования влияния РЭЧ И' РЭЧ, включенного в ПБЦА‘ наночастицы на экспрессию нейротрофических факторов BDNF и-NGE
in vivo
218.1 Подготовка образцов исследуемых отделов мозга in vivo
2.8.2 Выделение тотальной РНК из исследуемых отделов мозга крысы
2.9 Оценка вличния форм РЭЧ на экспрессию нейротрофинов NGF и BDNF для методов in vitro и in vivo
2.9.1 Определение обратной транскрипции с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.9.2 Оценка уровня экспрессии BDNF и NGF мРНК
2.10 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Синтез наночастиц и приготовление экспериментальных форм РЭЧ
3.1.1 Получение нанокапсулированных форм эритропоэтина на основе ПБЦА
3.1.2 Получение нанокапсулированных форм эритропоэтина на основе ПЛГА
3.1.3 Определение размеров наночастиц с помощью фотонной корреляционной спектроскопии
3.1.4 Электронно-микроскопическое изучение формы и размеров наночастиц
3.1.5 Определение степени включения РЭЧ в наночастицы
Глава 4. Изучение фармакологической
активности РЭЧ и его нанокапсулированных форм
4.1 Количественное
определение РЭЧ в тканях мозга экспериментальных животных
4.2 Изучение противогипоксических свойств новых наносомальных форм РЭЧ
4.2.1 Изучение противогипоксической активности новых соединений РЭЧ на модели гипоксии
с гиперкапнией в гермообъеме
4.2.2 Изучение противогипоксической активности новых соединений РЭЧ на модели гипобарической гипоксии в барокамере
4.2.3 Изучение противогипоксической активности новых соединений РЭЧна модели гемической гипоксии
4.3 Исследование эффективности новых форм РЭЧ на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта)
4.3.1 Исследование неврологического дефицита
крыс с ИПГ
4.3.2 Динамика выживания крыс с ИПГ
Отсутствие нормально работающего гена BDNF вызывает потерю нейронов в различных отделах мозга и раннюю постнатальную гибель животных [Conover J.C., 1997].
Связывание нейротрофина BDNF с Trk-рецепторами вызывает их активацию путем лиганд-индуцированной димеризации рецептора и автофосфорилирования внутриклеточных остатков тирозина [Schlessinger J., Ullrich А., 1992]. Активированный рецептор способен фосфорилировать несколько внутриклеточных мишеней [Segal R.A., 1996]. К белкам, которые активируются автофосфорилированным Trk-рецептором, относятся фосфолипаза Cl -g, адапторные белки, фосфатидилинозитол-3' киназа, протеинтирозинкиназа, вовлеченная в.: регуляцию клеточной* адгезии и
синаптической пластичности и. некоторые другие молекулы. В. свою очередь, активированные белки запускают Ras/MARK-каскад и фосфорилирование сигнал-регулируемых киназ, что приводит к увеличению концентрации кальция1 внутри1; клетки и последующей; активации кальций/кальмодулин-зависимых киназ и казеинкиназы 2, фосфорилированию CREB и дальнейшей активации* фосфатидилинозитол-3'-киназы [ObermeierA., 1993, Stephens R.M, 1994, Qian X., 1998, Iwasaki Y., 1998, Finkbeiner S., 1997].
Кроме того, как и все нейротрофины, BDNF связывается с Р75-рецепторами и , действуя через этот рецептор, может запускать программированную гибель клетки. Предполагается также, что именно через Р75 осуществляется ретроградный аксональный транспорт BDNF [Curtis R., 1995].
К одному из наиболее изученных нейротрофинов относится* NGF, который является представителем белково -пептидных регуляторов,
необходимых для нормального- роста, созревания, а также поддержания жизнедеятельности нейронов центральной и периферической нервной системы [Levi-Montalcini R., 1987]. Обладая нейротрофическим свойством, NGF оказывает модулирующее влияние также на иммунную и нейроэндокринную