Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации – масс-спектрометрии в ретроспективном токсикологическом анализе

• Автор: Дубровский, Ярослав Александрович
• Шифр специальности: 14.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 103 с. : 18 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фосфорорганические соединения

1.2. Сернистый иприт

1.3. Ацетилсалициловая кислота

1.4. Металл-аффинная хроматография

1.5. М А Л ДИ масс-спектрометрия

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Выявление и идентификация фосфонилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы
3.2. Выявление и идентификация алкилированных аддуктов белков крови
3.3. Выявление и идентификация ацетилированных аддуктов глобина человека и крысы
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Выявление и идентификация фосфорилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы
5.2. Выявление и идентификация алкилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы
5.3. Выявление и идентификация ацетилированных аддуктов глобина человека и крысы
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Белки и секретируемые пептиды могут приобретать различные
посттрансляционные модификации аминокислот в полипептидной цепи. В настоящее время описано большое количество посттрансляциионных модификаций белков и пептидов. Такие модификации, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, как правило, имеют важное функциональное значение и влияют на биологические функции белков; ряд других модификаций не имеют функционального значения. Кроме того, возможны
посттрансляционные модификации секреторных белков в результате
взаимодействия с чужеродными соединениями - ксенобиотиками. К которым относятся токсичные агенты и лекарственные средства.
Электро- и нуклеофильные химические соединения способны формировать ковалентные связи с белками, образуя аддукты (модификации, не имеющие общепринятого названия). В последнее время раздел биоорганической химии, который изучает такие модификации белков, получил собственное название -«аддуктомика». Большая часть опубликованных работ в этой области посвящена проблематике уничтожения химического оружия. В то же время, показана способность и ряда других ксенобиотиков формировать аддукты с белками.
Анализ биомедицинских проб позволяет по наличию определенных метаболитов токсичных агентов в организме человека или животного судить о факте отравления. Мощный инструментарий современной аналитической химии, как правило, направлен на идентификацию самого ксенобиотика или его метаболитов, которые в течение нескольких дней выводятся из организма. Аддукты токсиканта с белками могут сохраняться на протяжении всего времени жизни белка в организме и их можно рассматривать как долгоживущие биомаркеры экспозиции.
Для практических целей представляется целесообразным рассмотрение процедуры анализа посттрансляционных модификаций основных белков крови -сывороточного альбумина и гемоглобина, и сравнение с библиотекой

модификаций белков высокоопасными соединениями и/или лекарственными средствами. Выявление участка белка и идентификация аминокислотного остатка, участвующего в образовании аддукта, являются стабильным показателем, зависящим от третичной и четвертичной структуры белка, позволяющим установить факт воздействия. Разработанная процедура анализа белков крови для обнаружения аддуктов позволит значительно расширить спектр определяемых соединений и увеличить срок выявления факта экспозиции в токсикологическом анализе.
На сегодняшний день наиболее удобными для решения подобных задач являются иммунохимические и масс-спектрометрические методы анализа. Иммунохимические методы требуют наличия специфичных антител, которые не всегда возможно получить и охарактеризовать. Масс-спектрометрия с мягкими-методами ионизации является более универсальным методом биоорганического анализа. Следует отметить, что в последние годы большинство работ по исследованию аддуктов ксенобиотиков с белками выполнены с помощью приборов, имеющих в качестве источников ионов «электроспрей». Данный класс приборов отличается высокими требованиями к анализируемым образцам. До сих пор в очень немногих исследованиях в области анализа аддуктов используется метод матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ), хотя этот метод менее чувствителен к присутствию солей и других загрязняющих компонентов. МАЛДИ масс-спектрометрия является универсальным методом анализа белковых гидролизатов и выявления посттрансляционных модификаций, обеспечивающим быстрое получение обширных данных о составе образца.
Таким образом, разработка нового подхода, совмещающего в себе преимущества биоорганического, химико-токсикологического и масс-спектрометрического анализа аддуктов ксенобиотиков с белками представляется актуальной.

аналита прямо на мишень. Стоит отметить, что эта процедура также позволяет концентрировать анализируемые вещества, когда на колонку наносят 10 мкл пробы, а элюируют уже 1-1,5 мкл. Если в качестве элюента использовать раствор матрицы в полярном растворителе, качество нанесения образца получается максимально высоким.
При анализе методом МАЛДИ в масс-спектре пептидов чаще всего содержатся исключительно однозарядные ионы, что значительно облегчает интерпретацию данных, однако этот метода имеет существенный недостаток. В силу специфики источника ионов, образец должен быть кристаллическим, что делает невозможным его стыковку с жидкостным хроматографом, и, соответственно, проведение анализа в режиме on-line. Существуют системы позволяющие проводить анализ в режиме off-line. Одним из наиболее часто используемых методов разделения компонентов белковых смесей является гель-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия [103]. В полиакриламидном геле белки разделяются по заряду, который сообщает белкам додецилсульфат натрия, полученный заряд прямо коррелирует с молекулярной массой белка. Местоположение белка определяют после окрашивания геля красителем Кумасси G-250. Для проведения масс-спектрометрического анализа полосу, содержащую белок вырезают и трипсинолиз проводят непосредственно в геле.
В случае содержания в смеси белков с близкими молекулярными массами, белки могут не разделиться и мигрировать в электрическом поле одной полосой. Для получения индивидуально изолированного белка из смеси используют метод двумерного электрофореза.
Двумерный электрофорез (2D) является уникальным и востребованным инструментом в исследовании сложных белковых смесей. Метод был предложен в начале 1970-х годов и основан на последовательном применении изоэлектрофокусирования белков с их разделением по изоэлектрическим точкам и дальнейшем разделении по молекулярной массе методом электрофореза [104,105]. Метод позволяет получить двумерную картину индивидуально