Использование протеомных подходов для изучения гемопоэтических стволовых клеток и атеросклеротических поражений аорты

• Автор: Жуковский, Николай Сергеевич
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Протеомика как инструмент изучения клеток

1.2. Стволовые клетки, атеросклероз и протеомика

1.3. Гемопоэтические стволовые клетки как объект исследования

и использования в патофизиологии

1.3.1. Регуляторы ГСК

1.3.2. Альтернативные источники ГСК

1.3.3. Клиническая эффективность пуповинной крови

1.3.4. Протеомика ГСК
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Клеточные линии
2.2 Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК)
2.3 Клетки из интимы и медии аорты
2.4 Приготовление и оптимизация образцов для исследования
2.5 Последовательность (алгоритм) протеомного анализа
3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Влияние паратиреоидного гормона на остеобласты
3.2. Анализ протеома гемопоэтических стволовых клеток
3.2.1. Мононуклеарные клетки
3.2.2. Популяция С0341 гемопоэтических стволовых клеток
3.3. Изучение ассоциации протеомного профиля с атеросклерозом

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Реакция протеома остебластов на паратиреоидный гормон
4.2 Характеристика гемопоэтических стволовых клеток
4.2.1 Белковый профиль мононуклеарных клеток
4.2.2 Белковый профиль СЭ34+ ГСК
4.3 Протеомика атеросклероза и перспективы использования ГСК для терапии атеросклероза
ВЫВОДЫ
5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГСК - гемопоэтические стволовые клетки
ДЭ - двумерные электрофореграммы
ИФБ - изотонический фосфатный буфер, pH 7
ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование
ЛПНП - липопротеиды низкой плотности
МНК - мононуклеарные клетки
МСК. - мезенхимальные стволовые клетки
ПК - пуповинная кровь
ПТГ - паратиреоидный гормон
СК - стволовые клетки
ССС - сердечнососудистая система
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФБС - фетальная бычья сыворотка
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
CD34b ГСК - гемопоэтические стволовые клетки, несущие антиген CD34
2D - метод двумерного гель-электрофореза на полиакриламиде
FACS - активированная флуоресценцией сортировка клеток
GFP - зеленый флуоресцирующий белок
HSP - белки теплового шока (heat-shock proteins)
IMDM - ростовая среда для культивирования клеток Dulbecco М IPG стрипы - гелевые полоски иммобилизованных градиентов pH IL - интерлейкин
Jaggedl (Jagl) - синтетический (мышиный) рекомбинантный пептид, лиганд
MALDI-TOF (matrix assisted laser deionization time of flight) - матричная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия Notch-1 - рецептор, присутствующий на поверхности клеток

Выделение CD34+ с помощью магнитных сфер. Процедура включает в себя ресуспендирование клеточного сгустка в 300 мкл буфера (на 108 клеток). Следующая стадия - добавление 100 мкл FcR блокирующего реагента на 108 клеток, перемешивание и добавление 100 мкл гаптен-антител на 108 клеток, смешивание и инкубирование в течение 15 мин при 4°С для достижения оптимального слипания. Конечный объем для метки составляет 500 мкл на

10 клеток. Затем клетки тщательно промывают буфером, добавляя 10-20 раз окрашивающий объем (5-10 мл на 10* клеток), центрифугируют и полностью сливают супернатант, затем ресуспендируют сгусток осторожно, добавляя буфер до конечного объема 400 мкл на 108 клеток. Затем добавляют 100 мкл антигаптеновых микросфер на 108 клеток (конечный метящий объем составляет 500 мкл на 108 клеток), тщательно перемешивают и инкубируют 15 мин при температуре 4°С. Клетки затем отмывают и ресуспендируют, с клеточным сгустком, инкубируемым в 500 мкл буфера на 108 клеток. Колонка для магнитной сепарации определяется условиями эксперимента. Для масс-спектрометрии колонка заполняется и промывается 500 мкл буфера, клетки пропускаются через фильтр (с меш 30 мкл, нейлон), с удалением сгустков, фильтр смачивается буфером перед использованием. Затем клетки наносятся на колонку, пропускаются через нее для разделения и промываются буфером 3x500 мкл, колонка снимается с сепаратора, помещается в подходящую пробирку, на колонку наносится 1 мл буфера и элюируются задержанные клетки при использовании плунжера, что минимизирует количество клеток, потерянных на фильтре. Эта стадия повторяется нанесением элюированных клеток на новую колонку для менее чем 107 CD34+ клеток, затем смываются и элюируются буфером задержанные клетки.
Для культивирования выделенных ГСК использовали питательные среды RPMI 1640 (Sigma), L-15 (Sigma), DMEM/F12 (Sigma) и ПСП, содержащие 10% фетальной сыворотки плода коровы. Клетки высевали в культуральные 24 луночные плашки. Культивирование проводили при 37°С в увлажненной