Избирательная активация транс-репрессорной функции глюкокортикоидного рецептора в клетках гемобластозов

• Автор: Лесовая, Екатерина Андреевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Классификация гемобластозов
2.1.1. Миелоидные новообразования
2.1.2. Лимфоидные новообразования
2.1.3. Опухоли из гистиоцитов и тучных клеток
2.2. Терапия гемобластозов
2.2.1. Классическая химиотерапия с использованием кортикостероидов
2.2.2. Таргетная терапия гемобластозов
2.2.3. Роль глюкокортикоидов в терапии гемобластозов
2.3. Структура и функции глюкокортикоидного рецептора
2.3.1. Физиологическая роль глюкокортикоидов
2.3.2. Структура глюкокортикоидного рецептора
2.3.3. Механизмы ОЯ-оносредованной регуляции экспрессии генов
2.3.4. Механизмы развития резистентности к глюкокортикоидам
2.4. Лиганды вЯ
2.4.1. Эффекты различных лигандов вЯ
2.4.2. Модуляторы глюкокортикоидного рецептора
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Список используемых реактивов
3.2. Клеточные линии и обработка клеток
3.3. Используемые вектора
3.4. Трансформация бактериальных клеток
3.5. Выделение плазмидной ДНК
3.6. Приготовление сред и растворов для работы с бактериями
3.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.8. Транзиентная трансфекция и измерение активности люциферазы
3.9.Трансдукция клеток лентивирусными векторами
3.10. Секвснирование
3.11. Определение кинетики пролиферации
3.12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле с БОБ
3.13. Иммуноблоттинг

3.14. Выделение геномной ДНК
3.15. Выделение РНК
3.16. Реакция обратной транскрипции
3.17. ПЦР-амплификация
3.18. Определение уровня апоптоза
3.19. Бактериальный тест на мутагенную активность Эймса
3.14. Исследование влияния на активность эукариотической топоизомеразы I
3.15. Статистическая обработка данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Характеристика модельной системы лейкозов и лимфом человека
4.2. Оценка генотоксичности СрйА
4.2.1. Исследование мутагенной активности СрйА в тесте Эймса
4.2.2. Оценка влияния СрбА на активность эукариотической топоизомеразы
4.3. Анализ биологических эффектов СрйА на клетки лейкозов и лимфом
4.3.1. Антипролиферативный и проапоптотический эффекты СрйА
4.3.2. Влияние СрйА на функциональную активность в Я
4.3.3. Оценка транс-репрессорного потенциала СрбА
4.3.4. Оценка транс-активационного потенциала СрбА
4.4. Анализ совместного действия СрйА и протесомного ингибитора Бортезомиба (Вг) на клетки ИСЕВ и
4.4.1. Определение оптимальной дозы В2 и времени обработки клеток СЕМ и ИСЕВ
4.4.2. Синергизм антипролиферативных и проапототических эффектов Срс1А и ВЪ
4.4.3. Влияние ВЪ на «диссоциированные» свойства СрбА
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Особенности используемой модельной системы гемобластозов
5.2. Анализ влияния Срс1А на уровень экспрессии О Я и его ядерную транслокацию
5.3. Анализ транс-репрессорного и транс-активационного потенциала Срс1А
5.4. Анализ эффектов совместного применения Срс1А и (В/.)
5.5. Заключение
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЕК-клетки — клетки-естественные киллеры 2-АФ - 2-аминофлуорен BSA- бычий сывороточный альбумин BZ - Бортезомиб
CBG - кортикостероид-связывающий глобулин
CHOP - циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон
СОАР - циклофосфан, винкристин, цитозар, преднизолон
CpdA - -(4-ацетоксифенил)-2-хлор-1Ч-метилэтил аммоний хлорид
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
FA - флуоцинолона ацетонид
FGFR — рецептор фактора роста фибробластов
FKBP51 - белок, связывающий FK506
FKBP52 - белок, связывающий FK506
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
GC - глюкокортикоиды
GILZ - glucocorticoid-induced leyzine zipper, белок «индуцируемая глюкокортикоидами лейциновая молния»
GR - глюкокоргикоидный рецептор
GRE — регуляторные элементы глюкокортикоидов
HDAC-1 - гистоновая деацетилаза
HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
HIF1 - фактор, индуцирующий гипоксию
IG - иммуноглублин
1L-1 — интерлейкин
1L-6 - интерлейкин
KLF9 - Kruppel-подобный фактор
LY6G6D - Lymphocyte antigen 6 Complex, комплекс лимфоцитарного антигена-6 МКР-1 -фосфатаза-1 МАР-киназ
MPL - белок/ген вируса миелопролиферативного лейкоза mTOR - белок-мишень рапамицина у млекопитающих ОАА - опухоль-ассоциированный антиген PARP - полимераза поли(АДФ-рибозы)
PBS - фосфатно-солевой буфер
PDGFR - рецептор тромбоцитарного фактора роста
2.4.2. Модуляторы глюкокортикоидиого рецептора
- Агонисты и антагонисты
Противовоспалительный эффект агонистов GR коррелирует с их аффинностью к рецептору: Дексаметазон>Преднизолон>Кортизол [Miner et al, 2005]. Ранее был описан селективный лиганд GR, Дефлазакорт, для которого наблюдалось изменение терапевтического индекса в сторону увеличения эффективности и уменьшения побочных эффектов in vitro. Однако клинические испытания показали меньшую противовоспалительную эффективность, чем у Дексаметазона.
По сравнению с агонистами, которые активируют GR, антагонисты ингибируют его активность. Они также влияют на структуру рецептора, стабилизируя его, и конкурируют с эндогенными стероидами за связывание с GR. Наибольшее распространение антагонисты GR получили при терапии заболеваний, при которых уровень эндогенного кортизола ухудшает прогноз заболевания, как, например, при синдроме Иценко-Кушинга. Следует отметить, что полная блокировка GR может привести к развитито болезни Аддисона, поэтому необходим тщательный подбор дозировки препарата. Известные антагонисты GR, RU486 и ZK98299, являются его неселективными антагонистами, ингибирующими также прогестероновый рецептор. В литературе также описывается ряд селективных нестероидных антагонистов GR, которые препятствуют ядерной транслокации рецептора и его связыванию с ДНК in vitro. Также было показано значительное ингибирование рецептора этими соединениями in vivo [Katsumata et al, 1982, Schmidt et al, 1984, Miner et al, 2005].
- Модифицированные стероиды
«Мягкие» стероиды
Как альтернативный подход для достижения селективного функционирования GR рассматривают также изменение уровня препарата в органах и тканях. При подобном подходе высокие концентрации препарата наблюдаются только в очаге заболевания, во всем организме количество препарата минимально. Примером таких препаратов могут служить топические стероиды. В частности, была разработана серия 17в-глюкокортикоидов бутиролактонов. Эти высокоаффинные агонисты GR стабильны in vitro , но быстро гидролизуются сывороткой крови. Однако пока не получены данные об эффективности данных препаратов in vivo [Miner et al, 2005].