Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pH

• Автор: Юзбашев, Тигран Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Список сокращений:
ацетил-КоА (Acet-CoA) - ацетил кофермент-А
ВКПМ — Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГенБанк - База данных GenBank NCBI
НАДН (NADH) - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАДФН - никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный ОМГА - О-метилгидроксиламин
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПМР - протонный магнитный резонанс
п.н. (т.п.н.) - пар нуклеотидов (тысяч пар нуклеотидов)
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
5-F0A - 5-фтороротовая кислота
NCBI - National Center for Biotechnology Information
ORF - открытая рамка считывания
SDH гены - гены, кодирующие субъединицы сукцинатдегидрогеназы Ts-мутация (мутант) — термочувствительная мутация (мутант)
I. ВВЕДЕНИЕ
1. Актуальность темы
2. Цели и задачи исследования
3. Научная новизна
4. Практическая ценность работы
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Потребность в янтарной кислоте и перспективы ее производства
2. Пути синтеза янтарной кислоты в клетке
3. Механизм токсичного действия слабых органических кислот
4. Выбор метаболического пути и микроорганизма для продукции янтарной кислоты при низких значениях pH
5. Некоторые особенности центрального метаболизма 7 Нро1уЧса
6. Экологический аспект производства био-сукцината
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды и штаммы
2. Идентификация ОЮ1 в геноме 7. Иро1уНса
3. Конструирование плазмид р1Л1А-б80Н1 и р1Л1А-бб8ВН1
4. Конструирование плазмид риС19~иКАЗ-ЫРТ и рК-Ьр4<1-Ир2
5. Последовательное введение копий гена ЫР2 в геном 7. Нро1уИса
6. Конструирование штамма с Тв-мутацией в гене БОШ
7. Конструирование штамма с делецией по гену БОН2
8. Конструирование ига+ производного штамма от РоП
9. Химический мутагенез дрожжей 7. Нро1уНса
10. Условия культивирования и определение скорости роста
11. Периодическое культивирование в ферментере
12. ВЭЖХ анализ состава культуральной жидкости
13. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы
14. Измерение активности липазы
15. Гибридизация по Саузерну
16. Анализ 13С-изотопомеров янтарной кислоты
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ
1. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в штамме У. Нро1уНса РоН
1.1. Попытка инактивация гена БОН! в штамме У. ipolytica Ро 1[
1.2. Разработка подхода для отбора Тз-мутаций по летальным генам в У. Иро1уНса, на примере гена
1.3. Инактивация гена 8ПН2 в штамме У. Нро1уНса Ро1
1.4. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы в штаммах У. Нро1уИса, дефектных по субъединицам БбЫ и БсНП
1.5. Влияние инактивации субъединиц 8с11г1 и в У. Про1уИеа на продукцию
янтарной кислоты
2. Селекция штамма У Иро1уНса Ро 1ГДзс1Ь2 на повышение продукции янтарной кислоты
2.1. Селекция штамма Ро1/Авбк2 на повышение жизнеспособности
2.2. Селекция мутантов #3 и #18 на повышение устойчивости к янтарной кислоте
2.3. Селекция мутанта #18-12 на повышение устойчивости к янтарной кислоте
3. Характеризация полученного штамма У Нро1уИса# 18-12
3.1. Динамика накопления янтарной кислоты штаммом #18-12
3.2. Анализ метаболического пути синтеза янтарной кислоты в штамме У. Про1уИса, лишенном активности сукцинатдегидрогеназы
4. Разработка системы для последовательной многокопийной интегративной трансформации штаммов У. Нро1убса
4.1. Разработка интегративного вектора для последовательного введения копий в штаммы У. Нро1удса
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в штамме Y. lipolylica Polf
1.1. Попытка инактивация гена SDH1 в штамме Y. lipolytica Polf
Первые попытки получить штамм Y. lipolytica с делецией по одному из генов SDH1 и SDH2, кодирующих субъединицы сукцинатдегидрогеназы, оказались безуспешными. При этом были использованы конструкции, предназначенные для интеграции по двойному кроссинговеру (Рис. IV-5). Однако для подтверждения летальности таких делеций необходимы были более весомые доказательства. Кроме того, их фенотип мог оказаться условно летальным, т.е. штамм мог быть жизнеспособным в определенных условиях культивирования или при наличии определенных компонентов среды. Так, среди опубликованных работ не было данных, из которых могло быть известно о возможности инактивации этого фермента у такого облигатно аэробного микроорганизма, как дрожжи Y lipolytica. Предугадать эти условия на этапе отбора трансформантов не представлялось возможным.
Нами также была предпринята попытка инактивации гена SDH1 в два последовательных этапа рекомбинации (Alani et al. 1987). Для этих целей была сконструирована плазмида pURA-dSDHl. Из Рисунка IV-1 видно, что линеаризованная по сайту рестрикции Mlitl плазмида pURA-dSDHl может встраиваться в область промотора гена SDH1 по одиночному кроссинговеру. При встраивании по аддитивному механизму должны образовываться две копии гена SDH1, первая из них неактивная с делецией в 195 п.н., другая функциональная с геном дикого типа. При селекции на вырезание встроенной плазмиды на среде с 5-FOA могут образовываться два типа штаммов. При рекомбинации в области промотора гена SDH1 должен образовываться штамм с геном SDH1 дикого типа, тогда как при