Получение инсулин - продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток человека

• Автор: Федюнина, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Цель и задачи исследования
1.2. Научная новизна и практическая значимость
1.3. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1.4. Апробация работы
1.5. Публикации
1.6. Структура и объем диссертации
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ. АНАЛР13 ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
2.1. Развитие поджелудочной железы
2.2. Генетические механизмы развития поджелудочной железы
2.3. ФОРМИРОВАНИЕ ЭНТОДЕРМЫ
2.4. Ключевые гены панкреатической детерминации и дифференцировки
2.4.1.ГЕН PDX
2.4.2. ГЕНNKX2.
2.4.3. ГЕНЫ NKX6.1 HNKX6.
2.4.4. PTFlA
2.5. Гены эндокринной дифференцировки
2.5.1. NeuroD
2.5.2. Neurogenin
2.5.3. Notch сигнальный путь
2.5.4. HESl
2.5.5. ISLl
2.5.6.РАХ4ИРАХ
2.5.7. MAFА
2.6. Проблема лечения сахарного диабета
2.7. Сигнальный путь инсулина
2.8. Диабет зрелого типа у молодых (MODY)
2.9. Современные подходы к лечению инсулинзависимого сахарного диабета
2.9.1. Терапия, основанная на восстановлении регенерации в-клепок островков Лангерганса
2.9.2. Терапия, основанная на трансплантации островков Лангерганса
2.9.3. Терапия сушеного диабета с помощью стволовых клеток
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Получение культуры клеток
3.2. Выделение CD146+ популяции клеток
3.4. дифференцирование выделенных МСК
3.5. Получение аденовирусной конструкции
3.6. Трансфекция клеток и индукция панкреатической дифференцировки
3.7. Анализ экспрессии панкреатических маркерных генов
3.7.1. Анализ изменения транскрипции генов
3.7.2. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК
3.7.3. Анализ транскрипции инсулина во времени

3.7.4. ELISA (ТЕСТ НА ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ГЛЮКОЗЕ)
3.8. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Трансфекция рАо5-Рох1 стандартных МСК из жировой ткани и пупочного
КАНАТИКА ЧЕЛОВЕКА
4.2. Трансфекция рАо5-Рцх1 МСК пернваскулярного фенотипа из жировой ткани и
ПУПОЧНОГО КАНАТИКА ЧЕЛОВЕКА
4.3. Выбор условий дифференцировки трансфицированных популяций МСК СВ146+СВ31- ЧЕЛОВЕКА рА»5-Рох
4.4. Анализ экспрессии нестина в исследованных популяциях МСК
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
БСА бычнй сывороточный альбумин
МСК мультипотентные стромальные клетки
п.н. пар нуклеотидов
ПЖ поджелудочная железа
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ полимеразная цепная реакция в реальном времени
СД 1 сахарный диабет 1 типа
СК стволовые клетки
ФРФ-2 фактор роста фибробластов-
ЦПД цитопатическое действие
ЭСК эмбриональные стволовые клетки
bHLH basic helix-loop-helix
EGF epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста
GFP green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок
GLP1 glucagon like peptid-1, глюкагоноподобный пептид-
IiGF hepatocyte growth factor, фактор роста геггатоцитов
IGF-1 insulin- like growth factor-1, инсулиноподобный фактор роста -

IPF-1 insulin promoter factor-1, фактор промотора гена инсулина
МАРК mitogen-activated protein kinase, митоген-активируемая
протеин-киназа
MODY maturity onset diabetes of the young, диабет зрелого типа у
молодых
NGF nerve growth factor, фактор роста нервов
Ngn3 neurogenin 3, нейрогенин
NICD notch intracellular domen, Notch внутриклеточный домен
NK семейство натуральных киллеров
PDX1 pancreatic and duodenal homeobox-1, панкреатический
гомеобоксный ген -

ранних стадиях, но не в вентральной мезенхиме. Анализ области раннего дорсального зачатка у Isll-/- мышей выявила полный дорсальный агенез. Это подтверждает роль окружающей мезенхимы в инициации дорсального панкреатического отпочкования. Кроме того, Isll играет также роль в энтодермальном панкреатическом развитии (Ahlgren et al., 1997).
Не известны гены мишени для Isll, хотя и предполагается, что IAPP и Glucagon могут быть кандидатами на эту роль. Сходным образом, не установлено для каких генов Isll является геном-мишеныо. Экспрессия Isll ограничена постмитотическими эндокринными клетками. Следовательно, он не может участвовать в процессе селекции клеток эндокринных предшественников. Этот вывод согласуется с тем, что у Ngn3-/- животных не обнаруживается экспрессии Isll. Ngn3 или NeuroD не были идентифицированы во время анализа Isll-/- эмбрионов (Baeza et al., 2001). Isll , по-видимому, играет роль в ранних постмитотических эндокринных клетках, которая может быть связана с поддержанием жизнеспособности клеток.
2.5.6. Рах4 и Рахб
Рах4 и Рахб являются независимыми членами общего субкласса
семейства Рах генов (Noll et al., 1993; Mansouri et al., 1996; Dahl et al., 1997). Участие Pax4 и Рахб в панкреатическом эндокринном развитии продемонстрировано с помощью инактивации этих генов (St-Onge et al., 1997; Sosa-Pineda et al., 1997). Мыши, у которых отсутствует ген Рах4 погибают в течение первых дней после рождения (Sosa-Pineda et al., 1997). У них выявляется полное отсутствие (3- и d- клеток, а-клетки присутствуют, но они дизорганизованы.
Главной ролью Рах4 скорее всего является контроль f3- и d-клеточного развития после активации гена Ngn3. Непосредственным проявлением фенотипа мышей, дефицитных по гену Рахб является то, что они имеют реципрокный фенотип по сравнению с мутантами по гену Рах4 (St-Onge et al., 1997). В поджелудочной железе, очень мало а-клеток, тогда