Метанотрофы источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка

• Автор: Тихонова, Екатерина Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цель и задачи исследования
Научная новизна
Практическая значимость
Апробация работы
Публикации
Место проведения работы
Объем и структура диссертации
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л Экстремальные среды обитания, экстремофилы
1.2 Метан в биосфере
1.2.1 Метан как парниковый газ
1.2.2 Источники и стоки метана
1.3 Метанокисляющие микроорганизмы
1.3.1 Метанотрофы как специализированная группа метилотрофов
1.3.2 История изучения и классификация
1.3.3 Метанмонооксигеназа - ключевой фермент метанокисления
1.3.4 Метанотрофы новых филогенетических ветвей
1.4 Среды обитания
1.5 Метанотрофы экстремальных местообитаний
1.6 Микробное окисление метана в экосистемах наземных газогидротерм
1.7.1 Культуральные методы
1.7.2 Аналитические методы
1.7.3 Молекулярно-биологические методы
1.7.4 Микроскопические методы
1.7.5 Иммунофлуоресцентный метод
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты исследования
2.1.1 Кальдера вулкана Узон (Камчатка)
2.1.2 Условия и сроки отбора образцов
2.1.3 Определение содержания ионов
2.1.4 Измерение нативных концентраций метана
2.2 Определение скоростей метаболических процессов
2.2.1 Определение скорости потребления метана
2.3 Микроскопические методы
2.3.1 Световая микроскопия
2.3.2 Электронная микроскопия
2.4 Культуральные методы
2.4.1 Получение накопительных культур метанотрофов
2.4.2 Выделение чистых культур метанотрофов
2.5 Молекулярно-биологические методы
2.5.1 Выделение ДНК
2.5.2 Полимерная цепная реакция (ПЦР)
2.5.2.1 ПЦР-детекция прокариот
2.5.2.2 Количественная ПЦР
2.5.3 Электрофорез в агарозном геле
2.5.4 Создание библиотек клонов
2.5.5 Денатурирующий градиентный гель-электрофорез
2.5.6 Секвенирование
2.5.7 Филогенетический анализ

2.5.8 Депонирование нуклеотидных последовательностей
2.5.9 Гибридизация in situ с флуоресцентно-мечеными
олигонуклеотидными зондами (FISH)
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Характеристика гидротерм
3.2 Определение количества бактерий
методом электронной микроскопии
3.3 Интенсивность микробного окисления метана
3.4 Детекция метанотрофов методом ПЦР в реальном времени
3.5 Выявление метанокисляющих бактерий методом End-point PCR
3.6 Оценка разнообразия метанокисляющих бактерий в обогащенных образцах
3.6.1 Оценка состава метаболически активных клеток метанотрофов методом FISH
3.6.2 ПЦР-ДГГЭ анализ фрагмента генартоА
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

метана в морских осадках составляет от 70 до 300 Tr [Valentine, 2002]. Согласно исследованиям, проводимым на загрязненных пресных водах (Нидерланды), процессы анаэробного окисления метана непосредственно связаны с микроорганизмами, осуществляющими процесс денитрификации [Raghoebarsing et al., 2006]. В 2007 году представлены данные об этих организмах в торфяниках, в которых связь процесса с денитрификацией отрицается [Smemo & Yavitt, 2007].
Таким образом, на сегодняшний день данные о процессах анаэробного окисления метана довольно противоречивы. Единство взглядов состоит в том, что признается осуществление процессов анаэробного окисления метана в морских и пресноводных экосистемах, благодаря сообществам архей и/или бактерий действующих отдельно или как консорциум [Boetius et al., 2000; Raghoebarsing et al., 2006; Ettwig et al., 2010].
1.3.4.2 Метанотрофные представители филогенетической ветви
Verru сот icrobia
Тип Verrucomicrobia представлен филогенетически разнородными группами бактерий. Они образуют отдельный кластер на филогенетических деревьях и включают виды, населяющие различные водные и наземные места обитания, причем число культивируемых видов среди них невелико [Schlesner et al., 2006]. В классе Verrucomicrobia четко выделяется отдельный кластер, представленный термоацидофильными метанотрофами, составляющими, по-видимому, отдельную подгруппу.
Анализ функциональных генов ртоА, ттоХ и mxaV, кодирующих
включение мембрансвязанной метанмонооксигеназы, растворимой
метанмонооксигеназы и метанолдегидрогеназы соответственно,
используемые в качестве диагностических маркеров и представляющие
ферментную систему окисления метана для известных метанотрофов не
позволяет обнаруживать представителей данной подгруппы, так же как и
Southern blot анализ, использующий радиоактивные меченые ртоА и ттоХ
зонды и процесс амплификации генов для связывания аммоний