Особенности цитологии новых хищных грамотрицательных ультрамикробактерий

• Автор: Поливцева, Валентина Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Оглавление
Введение
Обзор литературы
1. Явление минимализации микробных клеток и понятие ультрамикробактерии (УМБ)
1.1. Минимальные размеры микробных клеток
1.2. Терминология для описания мелких микробных форм
2. Биоразнообразие У МБ
2.1. Ультрамикроклетки в природных местообитаниях
2.2. Методологические принципы поиска новых форм УМБ
2.3. Культивируемые УМБ
3. Прокариотный паразитизм
3.1. Стратегия взаимодействия «волчий стиль» (wolfpack)
3.2. Периплазматические хищники
3.3. Эпибионты
3.4. Цитоплазматические хищники
3.5. Хищники с неопределенной стратегией
4. Роль электронной микроскопии в выделении и изучении новых штаммов УМБ
Экспериментальная часть
5. Объекты и методы
5.1. Культуры бактерий
5.2. Микробиологические методы
5.3. Методы характеристики физиолого-биохимических свойств штаммов NF4 и NF5
5.4. Изучение взаимодействия культур УМБ с культурами тест-объектов - Bacillus subtilis АТСС6633 или Acidovorax delafieldii
5.5. Молекулярно-генетические методы исследования
5.6. Светооптические методы исследования
5.7. Электронномикроскопические методы исследования
6. Результаты и обсуждение
6.1. Морфология и ультраструктура клеток новых штаммов УМБ
6.2. Физиолого-биохимические свойства новых штаммов УМБ
6.3. Филогенетическое положение новых штаммов УМБ
6.4. Хищничество новых штаммов УМБ: адаптации на ультраструктурном уровне
6.4.1. Ультраструктура клетокЯ. delafieldii 39 и В. subtilis АТСС 6
6.4.2. Изучение взаимодействия штамма NF1 с гетеротрофными бактериями

6.4.3. Изучение взаимодействия штамма МР4 с гетеротрофными бактериями
6.5. Цитохимическое изучение адгезивного аппарата клеток хищников
6.5.1 Изучение взаимодействия клеток штамма 1ЧР1 и А. <Ле1<фе1с1И
6.5.2 Изучение взаимодействия штамма ОТ4 с В. зшЬИШ АТСС 6
6.6. Цитохимическая локализация щелочной фосфатазы
6.7. Механизм когезии клеток хищника и клеток жертв
Заключение
Выводы
Список сокращений и условных обозначений
Список использованной литературы

Введение
В настоящее время микробиологами получены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании и широком распространении в природе ультрамелких форм бактерий с объемом клеток менее 0,1 мкм3, т.е. близким к теоретически рассчитанному минимальному размеру клеток (Workshop, 1999, Schut et al., 1997; Cavicchioli and Ostrowski, 2003, 2003; Panikov, 2004; Duda et al., 2011; Дуда с соавт., 2012). Имеются свидетельства того, что ультрамикробактерии (УМБ) являются составной частью микробных сообществ многих природных экосистем: они обнаружены в почвах, илах, льдах Гренландии, многолетнемерзлых грунтах, кишечнике человека и насекомых, ризосфере растений (Vancanneyt et al, 2001, Janssen et al, 1997, Iizuka et al., 1998, Miteva, Brenchley, 2005, Geissinger et al., 2009). Ультрамелкие бактериальные формы являются представителями домена Bacteria, где их ближайшими родственниками являются виды с более крупными, типичными для бактерий клетками, что указывает на полифилетическое происхождение УМБ. Однако, несомненно, что таксономическое, физиолого-биохимическое разнообразие и экологическая роль в природе, а также происхождение УМБ - ещё слабо исследованная область микробиологии. Причины слабой изученности УМБ связаны с методическими трудностями при исследовании этих ультрамелких организмов (Torella and Morita, 1981, Rappe et al., 2002), обусловленными пределами разрешения светового микроскопа, а также характерньм медленным развитием колоний. По этой причине выделение нового вида УМБ еще недавно воспринималось как значительное открытие. Очевидно, что для изучения этого нового для исследователей аспекта мира микроорганизмов необходимы специальные подходы и инструментарий.
Мелким размерам клеток (объемом менее 0,1 мкм3) соответствуют малые размеры геномов - от 3,2 до 0,56 Mb. Высокая численность ультрамелких бактерий в морских экосистемах свидетельствует о существенном вкладе УМБ в формирование биомассы океана (Vancanneyt et al., 2001; Rappe et al., 2002). Изучение чистых культур УМБ показало, что они способны использовать в качестве субстратов различные органические соединения (Schut et al., 1993, 1995, 1997а, Giovannoni et al., 2005b), в том числе - полихлорированные бифенилы (May et al., 2008). Некоторые морские олиготрофные УМБ обладают протеородопсином и способны использовать в энергетическом метаболизме энергию солнечного света (Giovannoni et al., 2005а). Культивируемые формы УМБ характеризуются большим разнообразием морфологии, ультраструктурной организации, физиологии и биохимии. По строению

Разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии проводили на пластинках Kieselgel 60 F (Merck, Германия), предварительно отмытых в системе хлороформ:метанол (65:30 об/об). Одномерную хроматографию проводили в системе хлороформ :метанол :вода:аммиак (60:3 7,5:3,4:1).
Обнаружение фосфолипидов. Пластинки после извлечения из хроматографической камеры высушивали на воздухе в течение 30 мин и проявляли. Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и другие липиды со свободными аминогруппами проявляли 0,25% раствором нингидрина в ацетоне. Аминосодержащие липиды обнаруживались в виде розовофиолетовых пятен через 1-2 ч выдержки при комнатной температуре.
Для выявления холинсодержащих липидов использовали реагент Драгендорфа. Для его приготовления брали следующие растворы: 1) 1,7 г нитрата висмута, растворенного в 100 мл 20% уксусной кислоты; 2) 10 г иодида калия, растворенного в 25 мл. Непосредственно перед проявлением пластинок смешивали 20 мл раствора 1 с 5 мл раствора 2 и добавляли 70 мл воды. Полученной смесью опрыскивали хроматограммы. Через несколько минут холинсодержащие липиды проявлялись в виде оранжевых пятен.
Для обнаружения всех липидов кизельгелевые пластинки опрыскивали 10% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты и выдерживали их в сушильном шкафу при 80-100°С до появления на желтом фоне синих пятен липидов.
Определение жирнокислотного состава клеточных липидов
Анализ состава жирных кислот клеток был проведен д.б.н. Осиповьм Г.А. (Академическая группа академика Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва).
Лиофильно высушенные клетки (3 мг) обрабатывали в 0,4 мл IN НС1 в метаноле при 80°С в течение 3 часов (кислый метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали гексаном. Гексан упаривали, а сухой остаток силилировали в 20 мкл БСТФА 15мин при 80°С и разбавляли гексаном до 100 мкл.
Для анализа 1 мкл смеси вводили в инжектор системы газового хромато-масс-спектрометра АТ-5973В Agillent Technologies (США). Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм; неподвижная фаза HP-5ms Хьюлетт-Паккард с толщиной слоя 0,2 мкм. Хроматографирование проводили в режиме программирования температуры от 120 до 280°С со скоростью 5 град/мин. Температура инжектора и интерфейса 280°С.