Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней

• Автор: Елсукова, Александра Андреевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Эпизоотическая ситуация по АНС
2.2. Характеристика вириона
2.3. Геном вируса АЧС
2.4. Лабораторная диагностика АЧС
2.5. Методы типирования изолятов вируса АЧС
2.5.1. Серологическая дифференциация вируса АЧС
2.5.2. Физическое картирование генома вируса АЧС с помощью рестрикционного анализа
2.5.3. Генотипирование изолятов вируса АЧС на основе амплификации вариабельных участков генома
2.5.3.1. Метод частичного секвенирования амплифицированного фрагмента гена, кодирующего белок р
2.5.3.2. Метод анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома вируса АЧС
2.6. Заключение по обзору литературы
З.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Вирус
3.1.2. Животные
3.1.3. Культуры клеток
3.1.4. Бактериальный штамм и плазмида
3.1.5. Питательные ср еды
3.1.6. Ферменты
3.1.7. Растворы и реактивы
3.1.8. Лабораторное оборудование

3.2. Методы
3.2.1. Подготовка органов для выделения вируса
3.2.2. Выделение вируса
3.2.3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
3.2.4. Выделение и очистка нуклеиновых кислот
3.2.5. Идентификация генома вируса АЧС методом полимеразной
цепной реакции с электрофоретической детекцией
3.2.б.Электрофорез продуктов ПЦР
3.2.7. Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ
изолятов вируса АЧС
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Усовершенствование методов выявления вируса

4.1.1. Усовершенствование метода выявления ДНК вируса АЧС на
основе ПЦР с электрофоретической детекцией
4.1.1.1. Оптимизация условий проведения ПЦР в формате электрофоретической детекции
4.1.1.2. Конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей последовательность консервативной области гена р72 вируса АЧС
4.1.2. Разработка тест-системы для выявления генома вируса АЧС
методом ПЦР в формате реального времени
4.1.2.1 .Расчет праймеров для обнаружения генома вируса АЧС
методом ГИДР в режиме реального времени
4.1.2.2. Оптимизация условий проведения ПЦР в формате реального времени
4.2. Быстрый метод пробоподготовки для обнаружения ДНК вируса
АЧС методом ПЦР
4.3. Мониторинг африканской чумы свиней
4.4. Исследование основных биологических свойств (репродукция, вирулентность) изолятов вируса африканской чумы свиней,

циркулирующего в популяциях домашних и диких свиней на территории Российской Федерации
4.5. Определение генотипа и филогенетических связей изолятов, выделенных при вспышках африканской чумы свиней в Российской Федерации с изолятами вируса африканского и европейского происхождения
4.6. Оценка возможности использования метода анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома для генотипирования штаммов и изолятов вируса АЧС
4.6.1. Ген В602Ь
4.6.2. Ген КР86Л
4.6.3. Ген 12681,
4.6.4. Межгенный участок ШЗ]
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
9. ПРИЛОЖЕНИЯ
2.5.3. Генотипирование изолятов вируса АЧС на основе амплификации вариабельных участков генома; '
2.5.З.1. Метод частичного секвенирования амплифицированного
фрагмента гена, кодирующего основной структурный белок р
В 2003 ■ году Bastos et al. был впервые разработан метод генотипирования различных изолятов вируса АЧС на основе частичного секвенирования, 478-нуклеотидного фрагмента из С-терминальной * части гена, кодирующего р72". Данный метод позволял выявить ДНК вируса АЧС в течение 5 часов, и провести его молекулярно-генетическую характеристику в течение 48 часов, что; выгодно отличало данный метод от ранее использовавшегося*; для этой цели рестрикционного* анализа. С помощью данного метода авторы охарактеризовали 55 изолятов*вируса, в том числе и те, которые ранее исследовались с помощью метода. RFLP (анализ полиморфизма- длин* фрагментов рестрикции). Сравнительный анализ результатов этих двух методов показал, что с; новый* метод частичного секвенирования гена, кодирующего белок р72, позволяет разделить изоляты вируса на те же основные подгруппы, что и. метод RFLP. При анализе изолятов, различающихся по геофафическому происхождению, организму-хозяину, дате выделения, удалось, выделить 10 основных генотипов* вируса АЧС, циркулирующих на территории. Африки. В генотип, названный авторами ESAC-WA, были включены изоляты, выделенные' во время вспышек в Европе, южной Америке, западной Африке, странах Карибского бассейна. Напротив;, изоляты, имеющие южно- и восточноафриканское происхождение, были- высоко гетерогенны. После проведения филогенетического анализа с помощью методов. UPGMA, NJ, МР и ME авторы выделили 10 фупп изолятов. вируса, [Bastos ADS, 2003]. В: 2005 г. авторами были опубликованы,результаты исследований, в ходе которых они более подробно остановившись.на изолятах из Восточной Африки. Ими было выявлено 17 генотипов вируса АЧС, циркулирующих на территории Африки,