Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Lic16A Clostridium thermocellum

• Автор: Дворцов, Игорь Александрович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СВМ - углевод-связывающие модули (carbohydrate binding modules) СВМХ - изолированный модуль с ранее неизвестными функциями WGA - Wheat Germ Agglutinin из Triticum vulgaris BCC - бактериальная кристаллическая целлюлоза

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Распространенность СВМ
1.2 Функции СВМ
1.3 Пространственная структура СВМ
1.4 Взаимосвязь структуры и функции СВМ
1.5 Молекулярный механизм связывания СВМ
1.6 Множественные взаимодействия СВМ
1.7 Синергизм СВМ
1.8 Применения СВМ в биотехнологии
1.9 Clostridium thermocellum, продуцент термостабильных ферментов - перспективный объект для изучения различных СВМ
2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.2 Химические реагенты и ферменты
2.1.3 Бактериальные среды и условия культивирования
2.1.4 Выделение и анализ плазмидной ДНК
2.1.5 Выделение хромосомной ДНК Clostridium thermocellum
2.1.6 Введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки и экспрессия белков
2.1.7 Приготовление клеточных экстрактов и очистка белков
2.1.8 Измерение концентрации белков, белковый электрофорез и определение молярного веса белков
2.1.9 Исследование плавления белков
2.1.10 Полисахаридные субстраты

2.1.11 Определение ферментативной активности ламинариназы при гидролизе
2.1.12 Определение биохимических свойств ламинариназы и ее делеционных производных
2.1.13 Связывание с растворимыми полисахаридами
2.1.14 Связывание с нерастворимыми полисахаридами
2.1.15 Гель-проникаютцая хроматография
2.1.16 Анализ белковой последовательности
2.1.17 Компьютерный анализ белковых последовательностей
2.2 Результаты и обсуждение
2.2.1. Изучение функций вспомогательных модулей, прилегающих к каталитическому
2.2.1.1 Получение делеционных производных Lie 16А
2.2.1.2 Биохимические свойства делеционных производных
2.2.1.3 Плавление делеционных производных
2.2.1.4 Влияние прилегающих модулей на углевод-связывающие свойства каталитического модуля
2.2.2 Изучение свойств СВМХ
2.2.2.1 Получение и экспрессия изолированного СВМХ
22.2.2 Углевод-связывающие свойства СВМХ (СВМ54)
2.2.2.3 Спонтанный гидролиз СВМ
2.2.2.4 Получение и экспрессия С-концевой части СВМ54 - СВМ54С
2.2.2.5 Углевод-связывающие свойства СВМ54С
22.2.6 Структура сайтов СВМ
2.2.2.7 Анализ гомологов СВМ
2.2.2.8 Функции СВМ54 в Licl6A
2.2.3 Изучение свойств С-концевых CBM Licl6A
2.2.3.1 Получение и экспрессия С-концевых CBM Licl6A

интенсивным, иначе фермент не сможет обработать все возможные сайты поверхности кристаллического субстрата. Хотя СВМ г руппы А сильно связываются с кристаллической поверхностью (СВМ семейства 2а связываются практически необратимо), они остаются мобильными, т.е. гидролаза может «скользить» по поверхности углеводного кристалла, что объясняется изотропностью гидрофобных взаимодействий [84]. Увеличение аффинности - простейшее объяснение появления тандемов СВМ в ферментах. Могут быть и другие причины для этого. СВМ 17 и 28 семейств целлюлазы Се15 из Bacillus sp., находясь в тандеме, осуществляют сильное связывание с целлюлозой. Индивидуально эти СВМ распознают разные области аморфной целлюлозы. Таким образом, тандем осуществляет функцию не только сильного связывания, но и распознавания специфических участков субстрата, являющихся комбинацией индивидуальных сайтов связывания, что может влиять на каталитические свойства фермента. В этом случае тандем СВМ моделирует субстратную специфичность целлюлазы [83].
В качестве примера N, 1 -взаимодействий можно привести два СВМ семейства 29 NCP-1 -некаталитического компонента мультиферментного комплекса целлюлаз из Piromyces equi [85]. Оба модуля обладают практически одинаковыми углевод-связывающими свойствами, они связываются с ß-1,4-глкжанами и маннанами. Тандем модулей распознает целлюлозу и целлогексаозу, но не связывается с полимерами маннозы. Была получена ЗО-структура тандема в комплексе с целлогексаозой (рис. 12).