Разработка средств молекулярно-генетической идентификации вируса геморрагической болезни кроликов

• Автор: Бурмакина, Галина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 161 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
1Л Актуальность темы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цели и задачи исследования
1.4 Научная новизна исследований
1.5 Практическая значимость работы
1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
1.7 Апробация результатов работы
1.8 Публикации научных исследований
1.9 Основные положения, выносимые на защиту
1.10 Структура и объем диссертации
1.11 Личный вклад соискателя
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Распространение вирусной геморрагической болезни кроликов в мире. Эпизоотическая ситуация
2.2 Характеристика вируса геморрагической болезни кроликов
2.2.1 Таксономия вируса геморрагической болезни кроликов
2.2.2 Физико-химические характеристики вируса геморрагической болезни кроликов
2.2.3 Функциональная организация генома вируса геморрагической болезни кроликов
2.2.4 Биологические свойства вируса геморрагической болезни кроликов
2.3 Цикл репродукции вируса геморрагической болезни кроликов
2.4 Клинические признаки и гистопатологические изменения
2.5 Пути передачи вирусной геморрагической болезни кроликов

2.6 Профилактика, вакцинация и лечение
2.7 Диагностика
2.7.1 Эпизоотологическая и клиническая диагностика
2.7.2 Патоморфологическая диагностика
2.7.3 Лабораторная диагностика
2.8 Генетическое разнообразие и эволюция калицивирусов кроликов
2.8.1 Патогенные калицивирусы кроликов
2.8.2 Непатогенные калицивирусы кроликов
2.9 Заключение по обзору литературы
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Образцы патологического материала
3.1.3 Кровь и сыворотки
3.1.4 Животные
3.1.5 Соли, реагенты для приготовления питательных сред, растворов, буферных смесей, питательных сред
3.1.6 Растворы и реактивы
3.1.7 Праймеры
3.1.8 Плазмиды и бактериальные штаммы
3.1.9 Питательные среды
3.1.10 Наборы для выделения плазмидной ДНК
3.1.11 Набор для in vitro транскрипции РЖ
3.1.12 Наборы для нуклеотидного секвенирования
3.1.13 Лабораторное оборудование
3.2 Методы
3.2.1 Подбор праймеров и зондов
3.2.2 Подготовка органов и тканей
3.2.3 Постановка биопробы

3.2.4 Выделение нуклеиновых кислот
3.2.5 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза
3.2.6 Анализ ПЦР-продуктов
3.2.7 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.2.8 Нуклеотидное секвенирование
3.2.9 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидной последовательности фрагментов генома вируса ГБК
3.2.10 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР
3.2.11 In vitro транскрипция
3.2.12 Анализ in vitro транскрибированной РНК
3.2.13 Постановка ИФА
3.2.14 Проведение РТА
3.2.15 Определение характеристик тест-систем
3.2.16 Статистическая обработка результатов исследований
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Разработка средств генодиагностики вирусной геморрагической болезни кроликов
4.1.1 Разработка тест-системы на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов
4.1.1.1 Подбор специфических праймеров
4.1.1.2 Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов
4.1.1.3 Определение аналитической чувствительности тест-системы на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией
4.1.1.4 Разработка рекомбинантного положительного контроля амплификации

данного заболевания [76]. Кроме того, необходимо постоянно проводить исследования, направленные на изучение эволюции вируса, антигенных и молекулярно-генетических свойств изолятов, циркулирующих на данных территориях. Именно обнаружение новых генетических и антигенных вариантов позволит принять с адекватные меры по ликвидации болезни.
2.7 Диагностика
Диагноз на ВГБК ставят на основании эпизоотологических, клинических, патоморфологических данных и результатов лабораторных исследований. Следует дифференцировать ВГБК от пастереллеза, отравлений, тепловых ударов и других причин тяжелого сепсиса [6, 7, 8, 11, 18].
2.7.1 Эпизоотологическая и клиническая диагностика
При эпизоотологическом обследовании обращают внимание на общую эпизоотическую обстановку в хозяйстве, районе, состояние вакцинопрофилактики, условий содержания и кормления кроликов. Из специфических факторов учитывают следующее: массовая внезапная
гибель кроликов, в основном взрослых; невосприимчивость крольчат и других видов животных; быстрое распространение болезни и широкий охват поголовья [6, 8, 12].
На первых этапах эпизоотии болезнь обычно протекает молниеносно, без клинического проявления. Внешне здоровое животное неожиданно падает на бок, слегка выгибает спину, совершает судорожные движения и погибает. При более продолжительном течении за несколько часов до гибели температура тела у кроликов повышается, а затем нормализуется. Непосредственно перед смертью отмечают угнетение, кровянистые или желтоватые выделения из носа [4, 12].
2.7.2 Патоморфологическая диагностика
Наиболее значимые патоморфологические изменения при постановке диагноза на ВГБК:
- венозный застой в стенках носовых полостей и трахеи ("красная