Новые биокатализаторы регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы

• Автор: Савин, Святослав Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Синтез оптически активных соединений с помощью
ИАО(Р)+-зависимых дегидрогеназ
2.1.1. Общие основы регенерации NAD(P)H
2.1.2. Особенности ферментативной регенерации NAD(P)H
2.1.3. Формиатдегидрогеназы, используемые для регенерации NAD(P)H
2.2. Общие сведения о формиатдегидрогеназе
2.2.1. Локализация, физиологическая роль и клонирование генов ФДГ
2.2.1.1. Микроорганизмы
2.2.1.2. Высшие растения
2.2.1.1. Высшие эукариоты
2.2.2. Сравнительный анализ аминокислотных
последовательностей формиатдегидрогеназ
2.2.3. Пространственная структура формиатдегидрогеназ
2.2.4. Кинетические свойства формиатдегидрогеназ
2.2.5. Изучение и инженерия термостабильности формиатдегидрогеназ
2.2.5.1. Увеличение термостабильности РвеФДГ
2.2.5.2. Увеличение термостабильности СЬоФДГ
2.2.6. Химическая стабильность формиатдегидрогеназ
2.2.6.1. Увеличение химической стабильности ФДГ из Pseudomonas sp. 101 и Mycobacterium vaccae N
2.2.6.2. Увеличение химической стабильности ФДГ из C.boidinii
2.2.6.3. Методы оценки химической стабильности формиатдегидрогеназ
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы
3.2. Методы исследования
3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.2.2. Рестрикция фрагментов ДНК
3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля
3.2.4. Лигирование
3.2.5. Трансформация клеток E.coli
3.2.6. Выделение плазмидной ДНК
3.2.7. Направленный мутагенез формиатдегидрогеназ с помощью ПЦР
3.2.8. Направленный мутагенез формиатдегидрогеназ методом Кункеля
3.2.9. Секвенирование ДНК
3.2.10. Получение фазмидной ДНК в одноцепочечной форме для
проведения реакции направленного мутагенеза методом Кункеля
3.2.11. Выделение фага-помощника М13К
3.2.12. Определение количества бляшкообразующих единиц фага
3.2.13. Экспрессия SoyFDH и ее мутантов в клетках E.coli
3.2.14. Выделение и очистка SoyFDH
3.2.15. Экспрессия PseFDH и ее мутантов в клетках E.coli
3.2.16. Выделение и очистка РэеФДГ
3.2.17. Экспрессия СЬоФДГ в клетках E.coli
3.2.18. Выделение и очистка СЬоФДГ
3.2.19. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях
3.2.20. Определение активности фермента
3.2.21. Определение констант Михаэлиса
3.2.22. Титрование активных центров и расчет каталитических констант
3.2.23. Изучение термостабильности по кинетике инактивации
3.2.24. Сравнение эффективность феназинметасульфата и
5-метилфеназинметасульфата
3.2.25. Влияние концентрации тетранитротетразолия синего
3.2.26. Проведение формиатдегидрогеназной реакции на мембранах
3.2.27. Количественное определение фермента на мембранах
3.2.28. Анализ кристаллической структуры ФДГ и моделирование
трехмерной структуры мутантных ферментов
3.2.29. Исследование инактивации рекомбинантных ФДГ
пероксидом водорода
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Исследование термостабильности формиатдегидрогеназ
СЬоФДГ и РвеФДГ GAV, применяемых на практике
4. ] .1. Определение механизма термоинактивации
СЬоФДГ и РэеФДГ GAV
4.1.2. Анализ температурной зависимости констант скорости инактиваци
4.1.1. Зависимость термостабильности РэеФДГ GAV и СЬоФДГ
от концентрации фосфат-иона
4.1.4. Влияние формиат-иона на термостабильность СЬоФДГ
4.2. Разработка методики определения нанограммовых количеств формиатдегидрогеназы
4.2.1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов
4.2.2. Спектральные характеристики системы детекции ФДГ
4.2.3. Сравнение эффективности медиаторов ФМС и 5-метил-ФМС
4.2.4. Определение оптимальной концентрации ТНТ
4.3.1. Количественное определение ФДГ на мембранах
4.3. Белковая инженерия формиатдегидрогеназы сои
4.3.1. Выбор положений для направленного мутагенеза
4.3.2.Введение других замен для стабилизации ЭоуФДГ
4.3.3. Получение мутантных БоуФДГ
4.3.3.1. Введение мутаций в ген soyfdh
4.3.3.2. Экспрессия мутантных ферментов
4.3.3.3. Очистка мутантных БоуФДГ
4.3.4. Изучение кинетических свойств мутантных БоуФДГ
4.3.4.1. Определение максимальной скорости и констант Михаэлиса
4.3.4.2. Определение каталитической константы
4.3.5. Температурная стабильность мутантных БоуФДГ
4.4. Белковая инженерия формиатдегидрогеназы
бактерии Pseudomonas sp.
4.4.1. Компьютерный анализ структуры РэеФДГ
4.4.2. Введение мутаций в ген psefdh
4.4.3. Получение мутантных РБеФДГ с заменами
по остаткам Cysl45 и Cys
4.4.4. Кинетические свойства мутантных по остаткам
цистеина РэеФДГ
4.4.4.1. Определение максимальной скорости и
констант Михаэлиса
отметим также Asp308, карбоксильная группа которого образует водородную связь с амидной группой никотинамидного кольца NAD+ [134]. Подвижность ряда остатков (Phe98, Cys255, Gln313 и His332) сильно ограничена за счет соседства с остатком Pro. Особенно хорошо это проявляется для остатка Gln313, который в подавляющем большинстве ферментов зафиксирован двумя остатками Pro. В случае остатка в положении 122 (Ile или Val) картина абсолютно противоположная. Наличие разных остатков в этом положении связано с тем, что в образовании водородной связи с молекулой субстрата участие принимает, не боковая группа, а атом кислорода из карбонильной группы в основной цепи [134]. По-видимому, повышенная гибкость полипептидной цепи в этом положении, создаваемая за счет двух соседних остатков Gly, обеспечивает оптимальную ориентацию карбонильной группы остатка 122 относительно субстрата. Остатки Gly200 и Gly203 также обеспечивают максимальный контакт между участком ß-тяжа ßA и спиралью аВ для оптимального связывания NAD в активном центре.
2.2.3. Пространственная структура формиатдегидрогеназ
Несмотря на длительную историю исследования ФДГ, в литературе данные о пространственных структурах имеются лишь для ферментов из некоторых источников (бактерии Pseudomonas sp. 101, Moraxella sp.C-2, дрожжи C.boidinii и растения A.thaliana). Общей особенностью всех ЫАО+-зависимых формиатдегидрогеназ является наличие димерной структуры, а также NAD+- и субстрат-связывающего домена. Свободный фермент (апо-форма ФДГ) находится в "открытой" конформации. При образовании тройного комплекса [ФДГ-ПАО+-азид], структура которого считается аналогом структуры фермент-субстратного комплекса в переходном состоянии, происходит значительная компактизация белковой глобулы ФДГ и фермент переходит в "закрытую" конформацию. В таблице 2.3 представлен список известных трехмерных структур для формиатдегидрогеназ из различных источников.
В случае бактериальных ФДГ, детально изучены пространственные структуры для ферментов из бактерий Pseudomonas sp. 101 и Moraxella sp. С-2. В 1994 году получены структуры апо- и холо- формы PseFDH с разрешением 1,8 и 2,05 Â соответственно [57]. Позднее для этого фермента также получена структура двойного комплекса с формиатом [58]. Для фермента из бактерий Moraxella sp. С-2 также получены структуры свободного фермента и тройного комплекса с коферментом и ингибитором с атомным разрешением [62].