Участие ∆12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии

• Автор: Демин, Илья Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. Введение
Список сокращений
II. Обзор литературы
2.1. Основные понятия и термины, относящиеся к
низкотемпературному стрессу
2.2. Повреждения растений при гипотермии
2.3. Свободно-радикальные процессы в растительной
Клетке
2.4. Антиоксидантные системы растений
2.5. Адаптация растений к низкотемпературному стрессу
2.6. Роль мембранных липидов в устойчивости растений к гипотермии
2.7. Роль десатураз в устойчивости растений к
низкотемпературному стрессу
2.8. Использование достижений генетической инженерии в исследованиях холодоустойчивости растений
III. Объекты и методы исследования
3.1. Объект исследования
3.2. Культивирование растений
3.3. Доказательства наличия и экспрессии гетерологичного гена десатуразы
3.3.1. Выделение тотальной растительной ДНК
3.3.2. Проведение полимеразной цепной реакции
3.3.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.3.4. Выделение тотальной растительной РНК
3.3.5. Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
3.4. Определение содержания и состава жирных кислот липидов контрольных и трансгенных растений картофеля
3.5. Электромикроскопическое и морфометрическое исследование ультраструктуры хлоропластов
3.6. Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по
скорости С02-газообмена
3.7. Определение скорости генерации активных форм кислорода
3.8. Определение содержания перекиси водорода
3.9. Определение содержания продуктов ПОЛ по реакции с
тиобарбитуровой кислотой
3.10. Определение содержания диеновых конъюгатов
3.11. Определение устойчивости по выходу электролитов
3.12. Определение процента выживаемости контрольных и трансформированных растений
3.13. Исследование работы антиоксидантной системы контрольных и трансформированных растений
3.13.1. Определение активности
супероксиддисмутазы
3.13.2. Определение активности каталазы
3.13.3. Определение активности гваякол пероксидазы
3.14. Моделирование окислительного стресса растений путем
обработки их паракватом
3.15. Статистическая обработка результатов
IV. Результаты и обсуждение
4.1. Молекулярно-биологический анализ растений-трансформантов
4.2. Качественный и количественный состав ЖК мембранных липидов контрольных и трансформированных
растений картофеля
4.3. Исследование ультраструктурной организации хлоропластов контрольных и трансформированных растений картофеля
4.4. Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по
скорости СО г-газообмена
4.5. Устойчивость трансформированных и нетрансформированных растений к окислительному стрессу, вызванному действием
повреждающих низких температур
4.5.1. Скорость генерации активных форм кислорода в клетках контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии
4.5.2. Содержание перекиси водорода в клетках
контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии
4.5.3. Содержание диеновых конъюгатов жирных кислот в клетках контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии
4.5.4. Содержание малонового диальдегида в клетках
контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии
4.5.5. Изменение степени проницаемости мембран
контрольных и девА-НсВМЗ-растений
при гипотермии
4.5.6. Определение процента выживаемости контрольных и бевА-ПсВМЗ-растений после действия гипотермии
4.6. Активность антиоксидантных ферментов контрольных и трансформированных растений при гипотермии
4.6.1. Анализ изменений активности супероксиддисмутазы в листьях контрольных и дезА-ИсВМЗ-растений при

типа; Leu, лейциновая молния; PAS, PAS-домен. (Б) Схема активации Hik33 при снижении температуры. Снижение температуры приводит к уплотнению мембраны, что вызывает компрессию липидного бислоя (показано стрелками). В этих условиях трансмембранные домены сближаются с изменением конформации в районе линкера, что приводит к димеризации сенсора с последующим автофосфорилированием.
Аминоконцевой участок Hik33 содержит два грансмембранных домена (рис. 1) (Suzuki et. ah, 2000 б.). Результаты анализа изменений текучести мембран (Szalontai et ah, 2000, Inaba et ah, 2003) дают основания полагать, что Hik33 может распознавать эти изменения при снижении температуры. Видимо, Hik33 воспринимает снижение текучести мембраны как первичный сигнал холодового стресса.
Несмотря на накопление важнейших данных о путях передачи сигналов холодового стресса в растениях, практически ничего не известно о механизмах восприятия этих сигналов и о возможных сенсорах. Эксперименты, показавшие низкотемпературную индукцию генов, и данные, полученные с использованием химических модуляторов текучести мембран (Monroy, Dhindsa, 1995, Sangwan et al., 2002), позволяют предположить, что снижение текучести может быть вовлечено в восприятие холодового стресса клетками растений. Однако истинные температурные сенсоры пока еще не найдены.
Среди генов, отвечающих на снижение температуры окружающей среды особого внимания заслуживают десатуразы жирных кислот, обладающие способностью изменять текучесть биологических мембран, и, следовательно, влиять на устойчивость организмов к низкотемпературному стрессу.
2.7. Роль десатураз в устойчивости растений к низкотемпературному стрессу
В ходе эволюции практически все пойкилотермные организмы выработали биохимические пути оптимизации текучести своих мембран при изменении температуры. Основную роль в процессе такой оптимизации играют ферменты -десатуразы жирных кислот. Десатуразами называют ферменты, катализирующие превращение одинарной (С-С) связи между атомами углерода в ацильных цепях жирных кислот в двойные (С=С) связи (Лось, 2001). Образованные двойные связи