Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В

• Автор: Згода, Виктор Гаврилович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 293 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Цитохромы Р450, общая характеристика
СУР1А2
СУР1А2
СУР2В6
СУР2В6
Подсемейство СУР2С
СУР2Б6
СУР2Е1
Подсемейство СУРЗА
Протеомика, основные методы нротсомных исследований
Методы разделения белков, применяемые в протеомных исследованиях. 38 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ)
Особенности разделения мембранных белков
Безгелевые методы протеомного анализа
Методы протеомного анализа цитохромов Р450
Методы предварительного разделения белков суперсемейства Р450 в протеомике
Масс-спектрометрический анализ цитохромов Р450
Идентификация цитохромов Р450 в биологических объектах методами масс-спектрометрии
Методы количественного масс-спектрометрического анализа
Относительное масс-спектрометрическое количественное определение цитохромов Р450 без использования изотопной метк

Использование методов с введением изотопной метки для масс
спсктрометрического анализа цитохромов Р450
Фолдинг и сборка белков
Основная роль молекулярных шаперонов
Основы и нарушения белкового фолдинга
Классификация шаперонов
Система ШР70
Шаперонины
Система НБР90
Взаимосвязь трансляции и фолдинга
Поддержание протеома и сеть протеостаза
Протеостаз при старении и заболеваниях
Ко-трансляционная вставка гема в апофермент Р450
Встраивание гема в молекулу апофермента Р450
Факторы, определяющие аффинность взаимодействия тема с белком
Роль гема в фолдинге гемопротеинов
Ориентация гема в белке
Молекулярный механизм встраивая гема в Р450
Окислительная инактивация Р450
Окислительная инактивация цитохрома Р450 в процессе катализа и при
автоокислении
Исследование окислительной модификации тема и апофермента цитохрома
Р450 в монооксигеназной реконструированной системе Внутриклеточная окислительная модификация других маромолекул и их
деградация
Системы деградации белков
Убиквитин-зависимая 26Б протеасомная система
Система деградации белков эндоплазматического ретикулума Цитохромы Р450 как модель для изучения протеолитической деградации
интегральных белков ЭР
Деградация белков Р450
Деградация отдельных изоформ Р450
ERAD нативных CYP 3А4, 2С11 И 2В1 в S. CEREVISIAE
Заключение
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы
Протеомные методы анализа
Проведение гидролиза белков трипсином в растворе
Введение метки в пептиды тяжелыми атомами кислорода [180]
LC-ES1-MS/MS -анализ
Структурное и функциональное восстановление CYP2B1 in vitro
Обработка цитозоля GA-агарозой
Эффект GA и GSH на гемин-зависимое восстановление CYP2B1
Анализ вестерн-блот PIsp90
Анализ вестерн-блот микросом печени с антителами IgG против GRP94, GRP78 и ERp29
Ингибирование гемин-зависимого восстановления 2В1 антителами
Исследование деградации Р450 2В
Плазмиды для экспрессии CYP2B1
Экспрессионный вектор CYP2B1-3A4CT
Трансформация дрожжевых клеток плазмидами
Экспрессия CYP2B1 и CYP2B1-3A4CT в Escherichia coli, функциональная реконструкция монооксигеназной системы
Выделение микросом дрожжей
Иммуноблотинг CYP2B1
Методы исследования окислительной модификации цитохрома Р450 2В4. 143 Выделение НАДФН-цитохром Р450 редуктазы
Мономеризация CYP2B4 и НАДФН-цитохром Р450 редуктазы
Инактивация Р450 в монооксигеназной реконструированной системе
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

например избыточный вес или режим питания, могут влиять на активность CYP2E1 [105]. Этанол при нерегулярном использовании является ингибитором CYP2E1, но при хроническом употреблении спирты индуцируют данную изоформу Р450 [106].
CYP2E1 вовлечен в биотрансформацию большого числа низкомолекулярных токсинов и канцерогенов, включая нитрозамины табачного дыма, бензен, этанол, и ряда лекарственных средств: хлорзоксазон, ацетамииофен, дапсон. анилин и некоторые анестетики [107].
Изоформа CYP2E1 отличается значительной межиндивидуальной вариацией содержания. Показаны различия концентрации данной изоформы в печени более чем в 20 раз между индивидуумами. Идентифицировано несколько полиморфизмов гена. Активность CYP2E1 измеряют in vitro и in vivo по скорости гидроксилирования хлорзоксазона [108].
В экспериментах по ингибированию активности CYP2E1 используют диэтилдитиокарбамат, который является суицидным ингибитором CYP2E1 [109].
Подсемейство CYP3A
Ферменты подсемейства CYP3A являются наиболее представленными цитохромами Р450 в печени. Их содержание составляет от 30 до 40% от общего содержания Р450 печени, при этом данные ферменты вовлечены в метаболизм 40-30% лекарств, используемых в клинике. [110]. Подсемейство CYP3A представлено тремя функциональными изоформами: CYP3A4, CYP3A5 и CYP3A7 [1].
CYP3A4
CYP3A4, главным образом, экспрессирован в печени и тканях кишечника [111], его содержание и активность индуцируется рифампицином, барбитуратами, карбамазепином, дексаметазоном. Индукция фермента проходит как in vivo, так и в in vitro экспериментах на линиях первичных гепатоцитов [112]. Изоформа CYP3A4 играет важную роль в метаболизме почти трети всех лекарственных средств [110]. При этом активность CYP3A4 имеет огромную межиндивидуальную вариабельность (более 40 раз в микросомах печени). Различия в активности