Исследование сезонных изменений в микросомальной фракции, обогащенной Na,K-АТФазой, из почек сусликов Spermophilus undulatus

• Автор: Басевич, Евгений Викторович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 191 с. : ил.

Список сокращений
АДФ - Аденозиндифосфат
АНС - 8-Анилинонафтил-1-сульфат
АТФ — Аденозинтрифосфат
АТФаза - Аденозинтрифосфатфосфогидролаза (адепозинтрифосфатаза)
ГТФ — Гуанозинтрифосфат ИТФ - Инозинтрифосфат
НАД+ - Никотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДН — Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
ПААГ — Полиакриламидный гель
РНК - Рибонуклеиновая кислота
УТФ - Уридинтрифосфат
ФЕП - Фосфоенолпируват
ФСБ(Т) - Фосфатно-солевой буфер (содержащий Твин-20)
ЦТФ - Цитидинтрифосфат
ЭГТА- Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)- N,N,N’,N’-тетраацетат
ЭДТА - Этилендиаминтетраацетат
ЭПР - Электронный парамагнитный резонанс
GC-MS - Масс-спектр ометрия, сопряженная с газовой хроматографией GSH — глутатион (восстановленная форма)
GSSG - глутатиоиа дисульфид (окисленная форма)
LC-MS/MS — Тандемная масс-спектрометрия, сопряженная с высокоэффективной жидкостной хроматографией с нанопотоками PIPES - Пиперазин-Н.Ы’-бис(2-э’['ансульфонат)
PMSF - Фенилметансулфонилфторид
SDS - Додецилсульфат натрия
Tris - Трис(гидроксиметил)аминометан
Сокращения, принятые в тексте для обозначения аминокислот, соответствуют рекомендациям Комиссии по биохимической номенклатуре ЮР АС.

Оглавление
I. Введение
II. Обзор литературы
И. 1. Гибернация млекопитающих
II. 1.1. Отличительные особенности зимней спячки
млекопитающих
II. 1.2. Внешние причины, вызывающие зимнюю спячку
II. 1.3. Энергетика зимней спячки млекопитающих
II. 1.4. Годичный цикл гибернирующих млекопитающих
II. 1.5. Стадии гибернации млекопитающих
II. 1.6. Сезонные изменения, происходящие в органах и тканях
животных-гибернаторов
11.1.7. Регуляция активности ферментов при гибернации
11.2. №,К-аденозиитрифосфатаза
П.2.1. Общая характеристика №,К-АТФазы
11.2.2. Структурная организация Ыа,К-АТФазы
11.2.3. Изоформы субъединиц Na,К-АТФазы
11.2.4. Иа,К-АТФаза почек: функции, локализация в сегментах
нефронов и субпопуляции
И.2.5. Регуляция активности Иа,К-АТФазы
11.2.6. Регуляция Иа,К-АТФазы посредством
фосфорилирования
11.2.7. Глутатионилирование Иа,К-АТФазы
11.2.8. Белки, взаимодействующие с Иа,К-АТФазой
11.2.9. Ингибиторы Na,К-АТФазы
11.2.10. Влияние липидного окружения на функционирование транспортных АТФаз
П.2.11. Олигомерная организация транспортных АТФаз
II.2.12. Липидные микродомены (рафты) и локализация Na,K-
АТФазы в плазматической мембране
11.3. Функционирование Na,К-АТФазы в почках животных-
гибернаторов (история исследований)
III. Материалы и методы
III. 1. Экспериментальные животные
III.2. Получение микросомальных фракций

111.3. Определение концентрации белка
111.4. Регистрация АТФазной активности в сопряженной системе
111.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
111.6. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных
на питроцеллюлозной мембране
111.7. Анализ агрегации микросомальных белков методом ковалентных сшивок
III. 8. Определение нативного уровня фосфорилирования белков с
использованием флуоресцентного красителя Pro-Q Diamond
III.9. Авторадиография фосфорилированных эндогенными
протеинкиназами белков
III. 10. Идентификация белков методом масс-спектрометрии
III. 11. Определение жирнокислотного состава липидов и холестерина
в микросомах методом масс-спектрометрии
III. 12. Анализ структурного состояния липидной фазы микросом методом электронного парамагнитного резонанса спиновых
зондов
III. 13. Анализ свойств микросомальных мембран методом
флуоресцентной спектроскопии гидрофобных зондов
III. 14. Материалы
III. 15. Математическая обработка полученных результатов
III. 16. Программное обеспечение
IV. Результаты и их обсуждение
IV. 1. Характеристика микросомальных препаратов из почек
сусликов
IV.2. Сезонные изменения АТФазной активности в препаратах
микросом из почек сусликов
IV.3. Содержание ]Яа,К-АТФазы в микросомальных фракциях из
почек сусликов
IV.4. Ингибирование уабаином Ма,К-АТФазы в препаратах,
выделенных из почек сусликов
IV.5. Посттрансляциопные модификации белков микросомальных
фракций из почек сусликов
IV.6. Состав липидной фазы микросомальных мембран из почек
сусликов
IV.7. Структурное состояние липидной фазы микросом из почек
сусликов, оцененные с помощью спиновых и флуоресцентных
зондов
IV.8. Олигомерное состояние №1,К-АТФазы в микросомах из почек
сусликов
V. Заключение
VI. Выводы

в главе «Белки, взаимодействующие с №,К-АТФазой». у-Субъединица встраивается в мембрану только в составе aß-димера в стехиометрии la:lß:ly [Beguin et al., 1997], причем у-субъединида ассоциируется с М8-М10 трансмембранными доменами а-субъединицы [Pu et al., 2002].
Присутствие у-субъединицы в составе Na,К-АТФазы изменяет сродство фермента к одновалентным катионам: комплекс alßly имеет, меньшее сродство к ионам Na+ (относительно ионов К+ данные противоречивы), чем комплекс alßl [Arystarkhova et al., 1999; Geering et al., 2003]. Однако существующие различные изоформы у-субъединицы в разной степени изменяют сродство Na,К-АТФазы к ионам [Küster et al., 2000]. Помимо этого у-субъединица Na,К-АТФазы принимает участие в формировании центра связывания сердечных гликозидов [Mobasheri et al., 2000].
II.2.3. Изоформы субъединиц Na,К-АТФазы
В настоящее время у позвоночных обнаружены четыре изоформы а-субъединицы (а1, а2, аЗ и а4) и три изоформы ß-субъединицы (ßl, ß2 и ß3) Na,К-АТФазы, которые кодируются, различными генами [Shull et al., 1986; Martin-Vasallo et al., 1989]. Эти субъединицы могут сочетаться- в aß-димер в разных комбинациях. Образующиеся изоферменты характеризуются различными кинетическими свойствами, сродством к лигандам, чувствительностью к ингибиторам и по-разному распределены в тканях, а также в одной ткани в зависимости от стадии онгогенеза.
Для изоформ a-субъединицы характерна избирательная экспрессия в различных органах и тканях взрослой особи. В тканях распределение изоформ изменяется в процессе развития организма (регулируется гормонально), а также при некоторых патологиях [Blanco, Mercer, 1998; Urayama et al., 1989]. al-Изоформа обнаружена во всех тканях организма, она является единственной (или преобладающей) в сегментах почек [Doucet, Barlet, 1986; Farman et al., 1991; Barlet-Bas et al., 1993; Feraille et al., 1995; Mobasheri et al., 2000]. а2-Субъединица экспрессируется в нервной ткани, желудочках сердца, адипоцитах и является