Химические и структурные модификации анти-MDR1 малых интерферирующих РНК как факторы, определяющие нуклеазоустойчивость, биологическую активность и эффективность проникновения в клетки

• Автор: Петрова, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 137 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение
ГЛАВА 1. Структура, термодинамика и химия как факторы, определяющие биологическую активность э!РНК (Обзор литературы)

1.1 Введение

1.2 Влияние химических модификаций на эффективность РНК-

интерференции

1.2.1 Химические модификации нуклеотидов

1.2.1.1 Модификации рибозы

1.2.1.1.1 Введение заместителей в фуранозу

1.2.1.1.2 Структурные модификации фуранозного цикла

1.2.1.2 Модификации фосфатного остова
1.2.1.3 Химические модификации азотистых оснований
1.2.2 Химические модификации по концам э1РНК
1.2.2.1 Биоконъюгаты э1РНК
1.2.3 Комбинации химических модификаций
1.3 Влияние модификаций структуры дуплекса на эффективность РНК-интерференции
1.3.1 Влияние нуклеотидных замен в структуре б1РНК на ее интерферирующую активность
1.3.2 Влияние выступающих нуклеотидов по концам з1РНК на эффективность

РНК-интерференции
1.3.3 Антисмысловые аналоги з1РНК (оц-б1РНК)
1.3.4 дц-РНК (27-30-меры) как субстраты Дайсера
1.3.5 Малые сегментированные РНК
1.4 Заключение
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Оборудование
2.1.3 Клеточные линии
2.1.4 Олигорибонукпеотиды и б!РНК, использованные в работе
2.1.5 Растворы и буферы, использованные в работе
2.2 Методы
2.2.1 Наработка плазмиды рЕОРР/МРР
2.2.1.1 Трансформация компетентных клеток Е.соН штамма ОН5а

2.2.1.2 Выделение плазмидной ДНК
2.2.2 Формирование дуплексов гіРНК
2.2.3 Определение температуры плавления зіРНК
2.2.4 Введение остатка флуоресцеина в біРНК
2.2.5 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот
2.2.5.1 Электрофорез дуплексов в ПААГ в нативных условиях
2.2.5.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.6 Исследование нуклеазоустойчивости віРНК в ростовой среде с эмбриональной бычьей сывороткой
2.2.7 Картирование нуклеазочувствительных сайтов зіРНК
2.2.7.1 Введение [32Р] - метки по 5’-концу олигорибонуклеотидов
2.2.7.2 Статистическое расщепление олигорибонуклеотидов имидазолом
2.2.7.3 Расщепление олигорибонуклеотидов рибонуклеазой Т
2.2.7.4 Исследование паттерна деградации віРНК дуплексов в ростовой среде ЭМЕМ с 10 %-ной РВЭ
2.2.8 Исследование эффективности подавления экспрессии гена ЕОРР/МОЯ1 под действием анти-МИЯ1 5ІРНК
2.2.8.1 Исследование биологической активности віРНК методом флуоресцентной микроскопии
2.2.8.2 Исследование биологической активности віРНК методом проточной цитофлуорометрии
2.2.9 Исследование эффективности накопления РІТС-меченьїх віРНК в клетках
2.2.9.1 Оценка эффективности трансфекции клеток с помощью проточной цитофлуорометрии
2.2.9.2 Конфокальная флуоресцентная микроскопия
2.2.10 Исследование эффективности подавления синтеза Р-гликопротеина в клетках КВ-8-5 с помощью анти-МОЯ1 віРНК
2.2.10.1 Вестерн блот анализ (определение количества суммарного белка Р-гликопротеина)
2.2.10.2 Оценка уровня подавления мембранного Р-гликопротеина с помощью проточной цитофлуорометрии
2.2.11 Приготовление препаратов для измерения методом проточной цитофлуорометрии
2.2.12 Определение чувствительности клеток к винбластину (МТТ-тест)
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1 Исследование влияния селективной 2’-0-метильной модификации на свойства біРНК
3.1.1 Исследование влияния 2’-0-метильных аналогов нуклеотидов в

нуклеазочувствительных сайтах дуплекса на стабильность зіРНК в присутствии

3.1.2 Исследование интерферирующей активности анти-МОЯ1 віРНК в клетках НЕК
3.1.2.1 Исследование влияния селективной 2’-0-метильной модификации віЕ
на интерферирующую активность
3.1.2.2 Исследование влияния селективной 2’-0-метильной модификации зіЕ
на длительность ингибирующего действия
3.2 Исследование влияния структуры анти-МОЯ1 віРНК на эффективность РНК-интерференции
3.2.1 Одноцепочечные аналоги віРНК
3.2.1.1 Исследование влияния 2’-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе оц-віРНК на их нуклеазоустойчивость
3.2.1.2 Исследование влияния 2’-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе оц-зіРНК на эффективность их действия
3.2.2 «Вилкоподобные» віРНК
3.2.2.1 «Вилкоподобные» аналоги зіЕт
3.2.2.2 Исследование влияния количества и расположения некомплементарных оснований в составе «вилкоподобных» аналогов зіЕт
на ее интерферирующую активность
3.2.2.3 Исследование биологической активности 2’-0-метильных анти-МОЯ1 «вилкоподобных» аналогов гіРНК с четырьмя нуклеотидными заменами
3.2.2.4 Исследование влияния 2’-0-метильных аналогов в составе «вилкоподобных» зіРНК на их нуклеазоустойчивость
3.2.2.5 Исследование влияния 2’-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе «вилкоподобных» гіРНК Е-типа на их интерферирующую активность
3.2.2.6 Исследование продолжительности ингибирующего действия модифицированных и немодифицированных «классических» віРНК Е-типа и
их «вилкоподобных» вариантов
3.2.2.7 Исследование эффективности подавления синтеза Р-гликопротеина под действием селективно модифицированных анти-МОЯІ віРНК «классической» и «вилкоподобной» структуры
3.2.2.7.1 Анализ уровня суммарного Р-гликопротеина с помощью Вестерн блота
3.2.2.7.2 Анализ уровня мембранного Р-гликопротеина с помощью проточной цитофлуорометрии

рецепторов, фолат-содержащие siPHK способны проникать практически в любые раковые клетки человека, поскольку известно, что уровень экспрессии рецепторов фолата на поверхности раковых клеток значительно выше по сравнению с нормальными клетками [155]. Так в экспериментах in vivo было показано эффективное накопление флуоресцентно-меченого конъюгата siPHK и фолата, присоединенного с 5’- или З’-конца смысловой цепи через дисульфидную связь, в солидной опухоли мышей [139] (Таблица 1). Оценку активности действия siPHK в данной работе не проводили. В других работах [156, 157] доставку siPHK в клетки осуществляли с помощью фолат-содержащих конструкций. Следует отметить, что данные эксперименты (in vivo и in vitro) подтвердили перспективность использования фолата в качестве модификации, обеспечивающей специфическую доставку и высокую эффективность действия.
Введение остатков молекул природного происхождения в состав siPHK является одним из перспективных подходов невирусной доставки и в отличие от других подходов (доставка с помощью катионных липидов и полимеров, инъекции под высоким давлением), преимуществами использования биоконъюгатов являются: специфичность их проникновения в клетки и отсутствие токсических эффектов [69, 158-161]. Особенностью данного подхода является необходимость выбора подходящей модификации для конкретной задачи в силу специфичности взаимодействий лиганд-рецептор. С этой точки зрения, использование конъюгатов siPHK и холестерина или фолата in vivo менее специфично, поскольку LDL-рецепторы и рецепторы фолата экспрессируются на высоком уровне клетками различных типов [138, 155], однако более выгодным, если в рамки поставленной задачи не входит доставка siPHK только в определенный тип клеток.
1.2.3 Комбинации химических модификаций
При оптимизации дизайна siPHK введение модификаций одного типа в структуру дуплекса не всегда приводит к достижению желаемого эффекта, поскольку оказываемое ими действие может быть недостаточным и / или направленным на оптимизацию какого-либо конкретного параметра дуплекса. Таким образом, использование различных химических модификаций является распространенным подходом для оптимизации свойств малых интерферирующих РНК. Относительно увеличения нуклеазоустойчивости siPHK, рассматривают две стратегии использования химической модификации. Сторонники первой стратегии придерживаются подхода «экстенсивной» модификации, то есть введения как можно большего числа модифицированных аналогов нуклеотидов в состав siPHK. Оптимальный дизайн модифицированных siPHK в таком случае определяется эмпирически, то есть из анализа данных их нуклеазоустойчивости и биологической активности. Так, в экспериментах на мышах, зараженных вирусом гепатита В, полностью модифицированная siPHK проявляла более высокую активность,