Особенности структуры, экспрессии и взаимодействия с патогенами белка табака Nt-4/1

• Автор: Макарова, Светлана Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Транспорт вирусов по растению
1.1 Транспортные белки вирусов растений
1.2 Внутриклеточный транспорт
1.2.1 Роль микротрубочек во внутриклеточном транспорте
1.2.2 Роль микрофиламентов во внутриклеточном транспорте
1.2.3 Везикулярный транспорт
1.3. Межклеточный транспорт
1.3.1 Строение ПД
1.3.2 Транспорт через ПД
1.4 Дальний транспорт вирусов
1.4.1 Строение проводящей системы растений
1.4.2 Дальний транспорт вирусов по флоэме
1.4.2.1 Вирусы, для дальнего транспорта которых не нужен белок оболочки
1.4.2.2 Вирусы, для дальнего транспорта которых необходим белок оболочки40
1.4.2.3 Транспортные системы поти- и клостеровирусов
1.4.2.4 Флоэмно-ограниченные вирусы
2 Белки растений - участники вирусной и вироидной инфекции
2.1 Белки растений, необходимые для транспорта вирусов
2.2 Белки растений, негативно регулирующие транспорт вируса по растению 5 I
2.3 Белки растений, участвующие в жизненном цикле вироидов
2.4 4/1 белок растений
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1.0 ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Nt-4/l
2.0 СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКА Nt-4/l
2.1 Исследование вторичной структуры белка Nt-4/l
2.2 Ограниченный протеолиз белка Nt-4/l в клетках Е coli
2.3 Анализ третичной структуры белка Nt-4/l методом дифференциальной
сканирующей калориметрии

3.0 ОЛИГОМЕРИЗАЦИЯ
3.1 Изучение способности к олигомеризации белка N1-4/1 и его делеционных мутантов методом динамического лазерного светорассеяния
3.2 Визуализация мультимерных комплексов, образуемых белком N1-4/1, с помощью электронной микроскопии
4.0 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКА NN4/1
4.1 Анализ РНК-связывающей активности белка N1-4/1
4.2 /я itro взаимодействие белка ДЛгР 1 с РНК ВВКК
4.3 Картирование РНК-связывающего сайта белка NN4/1
4.4 Анализ РНК-связывающей активности белка N1-4/1 и его мутантов методом Норт-Вестерн гибридизации
4.5 Определение размера рибонуклеопротеидных комплексов методом динамического лазерного светорассеяния
5.0 ПРЕДСКАЗАНИЕ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА 4/1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Названия вирусов
ВТМ - вирус табачной мозаики (Tobacco mosaic virus, TMV)
ВНПД - вирус некротической пятнистости дыни (Melon necrotic spot virus, MNSV)
BMT - вирус морщинистости турнепса (Turnip crinkle virus, TCV)
ВПГ - вирус пятнистости гвоздики (Carnation mottled virus, CMV)
ВШМЯ - вирус штриховатой мозаики ячменя {Barley stripe mosaic virus, BSMV)
BCBK - вирус скрученности верхушек картофеля {Potato mop-top virus, PMTV)
ВЖС - вирус желтухи свеклы {Beetyellow virus, BYV)
ВГТ - вирус гравировки табака (Tobacco etch virus, TEV)
ПЛВМ - лолулатентный вирус мятлика {Poa semilatent virus, PSLV)
BKB - вирус короткоузлия винограда {GrapevineJanleaf virus, GFV)
ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты {Cauliflower mosaic virus, CaMV)
ВМБ - вирус мозаики бамбука {Bamboo mosaic virus, BaMV)
BOM - вирус огуречной мозаики {Cucumber mosaic virus, CMV)
ВОЖТ - вирус осветления жилок турнепса {Turnip vein clearing virus, TVCV)
ВМ1-СГ - вирус мозаики коровьего горошка {Cowpea mosaic virus, CPMV)
XBK - Х-вирус картофеля {Potato virus X, PVX)
BMB - вирус мозаики вигны {Cowpea mosaic virus, CMV)
BMA - вирус мозаики арахиса {Groundnut rosette virus, GRV)
ВПГТ - вирус пятнистой гнилостности томатов {Tomato spotted wilt virus, TSWV)
BHMKK - вирус некротической мозаики красного клевера {Red clover necrotic mosaic virus, RCNMV)
В111МП - вирус штриховатой мозаики пшеницы {Wheat streak mosaic virus, WSMV)
BCJ1K - вирус скручивания листьев картофеля {Potato leaf roll virus, PLRV)
ВЗЖС - вирус западной желтухи свеклы {Beet western yellow virus, BWYV)
BMP - вирус мозаики рапса {Oil-seed rape mosaic virus, ORMV)
BMoT - вирус мозаики турнепса {Turnip mosaic virus, TuMV)
ВПГТ - вирус пятнистой гнилостности томатов {Tomato spotted wilt virus, TSWV)

ВТМ - жестких палочек с диаметром 18 нм и длиной ЗООнм. В последующих работах (Dawson et al, 1988) было показано, что межклеточное распространение ВТМ происходит не в форме вириона, а в виде протяженного РНП комплекса с диаметром 2-2,5 нм (Citovsky el al, 1992). С помощью атомно-силовой микроскопии были проанализированы транспортные РНП комплексы других вирусов. Диаметр таких комплексов оказался 1,5-
3,5 нм (Andreev et al.. 2004; Kiselyova et al., 2001), что достаточно для прохождения через ГІД с диаметром в открытом состоянии 3-4 нм (Oparka et al., 1999). С помощью введения мутаций в ген транспортного белка ВТМ были определены участки, отвечающие за локализацию в районе ПД, изменения ее ППС и взаимодействия с РНК (Ding el al., 1992а; Citovsky et al., 1992).
Таким образом, 30K ВТМ взаимодействует со своей РНК и в форме РНП направляется к ПД, где происходит взаимодействие с белками, ассоциированными с ПД, в результате чего увеличивается ППС ПД, и вирусный геном транспортируется в соседнюю клетку (Lucas, 2006).
Для эффективного распространения вируса по растения существуют механизмы, предотвращающие попадание вирусных частиц в уже зараженные клетки растения-хозяина. Одним из таких механизмов является фосфорилирование транспортного белка киназами клеточных стенок (Tzfira et al, 2000).
Показано, что ТБ ВТМ подвергается фосфорилированию по С-терминальным остаткам Ser-258, Thr-261, Ser-265 in vitro протеинкиназами, ассоциированными с фракцией клеточных стенок (Cytovsky el al, 1993; Trutnyeva et al. 2005). In vivo в растениях N.tabacum и N.benthamiana, трансгенных по этому белку, фосфорилирование происходило по тем же сайтам (Waigmann et al. 2000). Предполагается, что фосфорилирование блокирует способность ТБ увеличивать ППСП и, соответственно, осуществлять транспортную функцию. Было показано, что в растениях N. tabacum нативный ТБ и белок с делецией С-концевого участка, содержащего сайты фосфорилирования, увеличивали ППСП, в то время как ТБ с мутациями, имитирующими фосфорилированное состояние (замена Ser-258, Thr-261, Ser-265 на остатки аспарагиновой кислоты), таким свойством не обладал. Более того, ВТМ с ТБ, имитирующим фосфорилированное состояние, был не способен заражать растения N.tabacum. Однако эффект фосфорилирования зависел и от вида растения-хозяина: в N. benthamiana внесённые мутации не влияли на распространение вируса и способность ТБ увеличивать ППСП (Waigmann el al, 2000; Trutnyeva et al, 2005).
Ещё одна важная функция фосфорилирования ТБ ВТМ - перевод вирусной РНК, находящейся в составе РНП-комплекса в присутствии ТБ ВТМ, из трансляционно