Метилирование ДНК и экспрессия генов транскрипционных факторов CBF у растений капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации

• Автор: Фарафонтов, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Адаптация растений к низкотемпературному стрессу
1.2. Регуляции экспрессии генов при холодовом стрессе
1.3. Статус метилирования ДНК растений и устойчивость к стрессовым
факторам среды
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследования
2.2. Выделение и очистка ДНК растений
2.3. Выделение и очистка РНК растений
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5. Выделение ДНК из бактерий
2.6. Аналитический гель-электрофорез ДНК
2.7. Препаративный гель-электрофорез и элюция ДНК
2.8. Подготовка компетентных клеток E.coli
2.9. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК
2.10. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом
2.11. Синтез кДНК
2.12. Полимеразная цепная реакция
2.13. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
2.14. Оценка степени метилирования ДНК
2.15. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.16. Статистическая обработка данных
2.17. Реактивы и материалы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение нуклеотидной последовательности гена СВР капусты
3.2. Экспрессия гена CBFкапусты при холодовом стрессе
3.3. Изменение уровня экспрессии гена CBF капусты при закаливании

растений
3.4. Изменение степени метилирования ДНК промоторной области гена CBF капусты Brassica oleracea L. при Холодовой акклимации
3.5. Степень метилирования ДНК промоторной области гена CBFкапусты Brassica oleracea L. при различных температурных условиях
выращивания
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выводы
Список сокращений и условных обозначений
ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Существенным фактором окружающей среды, ограничивающим географическое распространение и сроки вегетации растений, является пониженная температура. Многочисленные исследования показали, что холодостойкость - комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма (Guy et al., 2008). Она достигается в ходе так называемой Холодовой акклимации, которая происходит при экспозиции растений при низких незамораживающих температурах. Холодовая акклимация включает активацию множественных механизмов, вносящих вклад в повышение устойчивости растения к низкотемпературному стрессу. Понижение температуры приводит к индукции экспрессии определенных генов. Многие из этих генов, наряду с холодом, индуцируются также и некоторыми другими стрессовыми воздействиями. Показано, что гены холодового ответа кодируют разнообразный набор белков, включая ферменты дыхания и метаболизма углеводов и липидов, антиоксиданты, молекулярные шапероны, антифризные белки (Thomashow, 1999; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Walter et al., 2011).
Многие регулируемые холодом и дегидратацией гены в промоторных областях содержат одну или несколько копий последовательностей, обозначенных как DRE (dehydration-responsive element)/CRT (С-repeat) цис-элементы. С этими цис-элементами, в составе которых имеется консенсусная последовательность A/CCGACNT, связываются транскрипционные факторы CBF1, CBF2 и CBF3 (CRT-binding factor), в результате чего транскрипция генов, регулируемых холодом или дегидратацией, значительно активируется. Различия в устойчивости растений к низким температурам, определяемые экспрессией регулируемых холодом генов, могут быть обусловлены разным набором генов, относящихся к CBF-регулону, которых у теплолюбивых растений обнаруживается меньше, чем у растений, способных к Холодовой акклимации, или отличиями в строении промоторных областей COR (cold-responsive)-reHOB по количеству
предварительно обрабатывали 70%-ным этанолом для исключения заражения микрофлорой. Растительный материал растирали в ступке с жидким азотом до порошкообразного состояния, не допуская его размораживания. Затем его переносили в колбу, добавляли 5-10 объемов (по отношению к исходной навеске растительного материала) экстрагента, содержащего 100 мМ трис-НС1 pH 8.0, 20 мМ ЭДТА, 1%-ный ДДС натрия, и слегка помешивая, прогревали на водяной бане при 60°С в течение 10 мин. Охладив суспензию до комнатной температуры к ней добавляли 5М ЫаСЮ4 до конечной концентрации 1 М. Экстракцию ДНК с ее одновременной депротеинизацией осуществляли, встряхивая гомогенат с равным объемом (по отношению ко всему объему гомогената) смеси 80%-ного свежеперегнанного фенола (доведенного до pH 8.0 или с помощью многократных насыщающих встряхиваний с трис-НС1, pH 8.0 или путем добавления 5 М NaOH из расчета 1.5 мл щелочи на 100 мл фенола), хлороформа и изоамилового спирта (взятых в соотношении 25:24:1) в течение 40 - 60 мин на встряхивателе типа 358S (Elpan, Польша). Смесь расслаивали центрифугированием при 2500 об/мин в течение 20 мин в центрифуге Avanti J-E (Beckman Coulter, США). Верхний водно-солевой слой, содержащий нуклеиновые кислоты, отбирали пипеткой с широким оплавленным кончиком и повторно депротеинизировали хлороформом (здесь и далее при упоминании хлороформа имеется ввиду его смесь с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1) в течение 20 минут. Затем смесь центрифугировали и ДНК осаждали, перенося водно-солевую фазу в колбу с двумя объемами охлажденного 96%-ного этанола. Спиртовой осадок ДНК собирали центрифугированием, промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола, подсушивали и растворяли в минимальном объеме 1хТЕ буфера. Подкисление растворов ДНК уксусной кислотой до pH 5.5 (достигаемое добавлением около 1/20 объема 20%-ной уксусной кислоты) перед осаждением способствовало более быстрому формированию осадка. Однако более важным являлось то, что подкисление растворов ДНК перед осаждением приводило к значительному осветлению растворов ДНК и в меньшей степени соосаждало с ДНК различные растительные пигменты.