Изучение факторов, влияющих на биосинтез L-аспарагиновой кислоты в Pantoea ananatis и Escherichia coli

• Автор: Куваева, Татьяна Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цель и задачи работы
Научная новизна и практическая значимость работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРТУРЫ
1Л L-аспарагиновая кислота: применение и перспективы
1ЛЛ Применение L-аспарагиновой кислоты
1 Л.2 Современное производство L-аспарагиновой кислоты
1 Л.З Перспективы микробиологического синтеза L-аспарагиновой кислоты из углеводов
1.2 Метаболизм L-аспарагиновой кислоты в энтеробактериях и потенциальные мишени для метаболической инженерии штамма-продуцента
1.2Л Аспартатаминотрансфераза
1.2.2 Взаимные превращения фосфоенолпирувата, оксалоацетата и пирувата
1.2.3 Цикл Кребса
1.2.4 Аспартаза и деградация L-аспарагиновой кислоты
1.2.5 Семейство аспарагиновой кислоты
1.3 Ассимиляция азота (аммиака) в энтеробактериях
1.3.1 Источники азота
1.3.2 Ассимиляция аммиака и внутриклеточные доноры азота
1.3.3 Глутаминсинтетаза и регуляция ассимиляции аммиака
1.3.4 Транспорт NH^/NH?
1.4. Аспартатдегидрогеназы
1.4.1 Термофильные АДГ(гш и АДГа&, необходимы для биосинтеза НАД+
1.4.2 Мезофильные АДГгеи и АДГрае как катаболитные ферменты
1.4.3 Возможное применение аспартатдегидрогеназ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2 Среды и реактивы

2.3 ДНК-манипуляции
2.4 Р1 трансдукция клеток E. coli
2.5 Электротрансформация клеток P. ananatis плазмидной ДНК
2.6 Электротрансформация клеток Р. ananatis геномной ДНК
2.7 Конструирование интегративных кассет для инактивации генов в хромосоме Р. ananatis
2.8 Конструирование интегративной кассеты для замены собственного промотора гена gdhA Р. ananatis на искусственный промотор Ptac
2.9 Конструирование интегративной кассеты для делеции гена ррс
Р. ananatis
2.10 ÀRed-зависимая интеграция двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому Р. ananatis
2.11 Mnt/Xis-зависимое удаление селективного маркера из хромосомы
Р. ananatis
2.12 Конструирование плазмиды pMWaspC
2.13 Конструирование интегративной плазмиды pMIVK620S
2.14 Интеграция mini-Mu-кассеты в хромосому Р. ananatis
2.15 Определение ферментативных активностей в клеточных экстрактах.
2.16 Интеграция гена ТМ1643 Т. maritima в хромосому Р. ananatis
2.17 Конструирование плазмиды pET-ADH-P
2.18 Конструирование плазмид pET15-ADH-Rp и pET15-ADH-Bj
2.19 Очистка аспартатдегидрогеназ
2.20 Определение активности аспартатдегидрогеназы
2.21 Интеграция гена, кодирующего аспартатдегидрогеназу из
В. japonicum, в хромосому E. coli
2.22 Аналитические методы
2.23 Определение оксалоацетата, ионов аммония, L-аспарагиновой и L-глутаминовой кислот
2.24 Определение концентрации L-аргинина
2.25 Олигонуклеотиды
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Сравнение путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты в E. coli и Р. ananatis

3.1.1 Реконструкция путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой
кислоты в P. ananatis на основании полной нуклеотидной последовательности генома
3.1.2 Экспериментальная проверка предложенной схемы путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты в P. ananatis
3.1.2.1 Аспартатаминотрансферазная реакция
3.1.2.2 Фосфоенолпируват-карбоксилазная реакция
3.1.2.3 Синтез глутамата
3.1.2.4 ОРС gdhA кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу
3.1.2.5 Утилизация аспартата в качестве источника углерода
3.1.2.6 Утилизация глутамата в качестве источника углерода
3.1.2.7 Утилизация фумарата
3.2 Генетические факторы, необходимые для продукции L-аспартата в
P. ananatis
3.2.1 Роль делеций A aspA, Agit А и AsucA, а также амплификации генов ФЕП-карбоксилазы, глутаматдегидрогеназы и
аспартатаминотрансферазы в продукции L-аспартата
3.2.2 Инактивация пируваткиназ РукА и PykF
3.2.3 Интеграция аллеля ppcK620S и отбор штамма, устойчивого к L-аспартату
3.2.4 Инактивация малатдегидрогеназы и глюкозодегидрогеназы
3.2.5 Использование НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы из
P. ananatis для продукции L-аспартата
3.3 Новые L-аспартатдегидрогеназы из мезофильных бактерий
Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum
3.3.1 Поиск анаболических аспартатдегидрогеназ в геномах бактерий.
3.3.2 Экспрессия выбранных генов предполагаемых
аспартатдегидрогеназ в Е. соїі
3.3.3 Очистка и биохимическая характеристика новых дегидрогеназ
3.3.4 Субстратная специфичность и кинетические параметры новых АДГроЬ ГиСб-АДГгра и Гис6-АДГЬіа
3.3.5 Различия аспартатдегидрогеназ из двух подгрупп на основе ферментативной кинетики
3.3.6 Различия в кофакторной специфичности аспартатдегидрогеназ из Роїаготопаз ьр. и В. ]аропісит на основе гомологичного моделирования пространственных структур

1.3.4 Транспорт NH4+/NH
Аммиак включается в клеточные процессы только после его транспорта через клеточную мембрану. Однако только незаряженный NH3 может свободно диффундировать через мембрану с высокой проницаемостью (Kleiner, 1981; Soupene et al., 1998; Winkler, 2006). В водном растворе NH4+ и NH3 находятся в равновесии с рКа 9,25, поэтому при pH 7,0 доля незаряженной формы NH3 составляет менее 1%. При высокой концентрации аммония в среде (10-20 мМ (NH4+ + NH3) в стандартных условиях) пассивного прохождения через мембрану незаряженного NH3 обычно достаточно для роста бактерий. Однако при низкой концентрации внешнего аммония (~ 10 мкМ), когда пассивная диффузия NH3 через билипидный слой становится недостаточной, чтобы удовлетворить потребности клеток в азоте, поглощение NH47NH3 обеспечивают специфические транспортные системы.
Мембранный белок AmtB (ammomium/methylammonium transporter В) представитель суперсемейства Amt/Rh/MEP, участвует в захвате NH4+/NH3 в энтеробактериях, и скорее является NH3-проводящим каналом, чем активным транспортером иона NH4+ (Soupene et al., 2002; Zheng et al., 2004; Khademi et al., 2004; см. обзор Winkler, 2006). Механизм транспорта и природа транспортируемого субстрата, NH/ или NH3, долгое время оставались не ясными.
В лаборатории Kustu показали, что функционирование AmtB требуется для роста клеток E. coli и S. typhimurium при низком уровне внеклеточного NH3 (около 50 нМ или меньше) (Soupene et al., 1998; Soupene et al., 2002). Ha основе ростовых характеристик amtB мутантов предположили, что AmtB увеличивает скорость двунаправленной диффузии незаряженного NH3 через клеточную мембрану. Впоследствии эта точка зрения была подтверждена первыми работами по анализу кристаллической структуры AmtB из E. coli (Zheng et al., 2004; Khademi et al., 2004).