Основной белок миелина (получение моноклональных антител, разработка иммуноферментного анализа и клинико-лабораторное применение)

• Автор: Семенова, Анна Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с.

ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
"Осиемой белок ммлана диагностике демнелннизнруюгамх процессов ЦНС"
1.1 Структура и функцни миелина
12 Основной белок миелина. Структура, функции, физико-химические свойства.
1.3. Биологическая роль ОБМ.
1 4 ОБМ в филогенезе и онтогенезе.
15. Клинико-диагностическое значение ОБМ ГЛАВА
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика изучаемого материала.
2.2. Методы очистки антигенов
2.3. Получение ангисывороток к ОБМ и их анализ.
2.4. Методы иммунохимического анализа.
2.5. Методы количественного определения белков,
2.6. Иммуноферментный анализ.
2.7. Иммунофлюоресцентный анализ
2.8 Общая клиническая характеристика обследованных детей.
ГЛАВА 3.
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ОБМ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.
3.1. Выделение ОБМ
3.2. Изучение физико-химических свойств и химической характеристики ОБМ
ГЛАВА
ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ОБМ.
4 1 Получение гибридом продуцирующих моноклональные анти-ОБМ-антитела.
4 2 Получение моноклональных анти-ОБМ-антител из асцитической жидкости.
ГЛАВА 5.
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ОБМ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА.
5 1 Разработка иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях и экстрактах из тканей человека и животных
5.2 Разработка иммуноферментного анализа анти-ОБМ-АТ в биологических жидкостях человека и животных
5.3. Результаты иммунохимического определения ОБМ и антител к нему в сыворотке крови детей с перинатальной патологией ЦНС ГЛАВА
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ
АГ - антиген АС - антисыворотка АТ - антитела
ВЖК - внутрижелудочковое кровоизлияние ГВ - гестационный возраст
БАЕ - экспериментальный аллергический энцефаломиелит
ИФА - иммуноферментный анализ
НСГ - нейросонография
ОБМ - основной белок миелина
ОФД - ортофенилендиамин
ПААТ - полиакриламидный гель
ПАФ - полный адьювант Фрейнда
ПВЛ - перивентрикулярная лейкомаляция
ПНС - периферическая нервная система
РИА - радиоиммунный анализ
РС - рассеянный склероз
СМЖ - спинномозговая жидкость
СЭК - субэпиндимальное кровоизлияние
ЦНС - центральная нервная система
ЭЭГ - электроэнцефалография
Б08 - додецил-сульфат натрия
ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы
Основной белок миелина - доминирующий структурный компонент мембраны мие-линобразующих клеток, справедливо рассматривается сегодня, в качестве одного из наиболее информативных маркеров патологических состояний, сопровождающихся нарушением целостности миелиновой оболочки [2, 5, 9, 21, 103, 108, 146, 147, 249, 261]. Иммуно-химический анализ ОБМ широко применяется в клинике демиелинизирующих заболеваний с целью оценки остроты процесса и вероятности возникновения рецидивов [1, 5, 7, 9, 26, 103, 200, 231, 257]. Комплексная оценка уровня ОБМ и анти-ОБМ-антигел в биологических жидкостях человека открывает возможность детального анализа процессов, сопровождающихся нарушением миелинизации [7, 21, 230, 272, 273, 274, 275]. Прогностическая значимость ОБМ и анти-ОБМ-антигел в качестве маркеров, отражающих состояние белого вещества головного мозга, отмечается при травматическом повреждении головного мозга воспалительных и опухолевых процессах в нервной ткани, преимущественно затрагивающих ее глиальный компонент [192, 198, 256, 292]. Динамический мониторинг ОБМ при ишемических и геморрагических повреждениях головного мозга позволяет не только характеризовать степень вовлечения в патологический процесс миелин-продуцирующих клеток, но и осуществлять контроль эффективности проводимой терапии [249].
В педиатрической практике помимо вышеперечисленных направлений, детекция ОБМ и анти-ОБМ-антител приобретает особую актуальность в клинике постгеморрагиче-ской гидроцефалии, позволяя решать вопрос о целесообразности проведения операции шунтирования [88, 108, 142, 143, 154, 155, 217]
Крайне важной проблемой, приобретающей с каждым днем все большее значение, является патология плода и новорожденного, вызванная хронической внутриутробной гипоксией и острой асфиксией Задержка процессов миелинизации, отражающаяся на темпах моторного и психического развития таких детей становится острейшей проблемой, с которой практически ежедневно сталкиваются педиатры. Оценка уровня ОБМ в данном аспекте является прогностически ценной с позиции решения принципиального вопроса об органическом или функциональном повреждении вещества ЦНС [22, 54, 108, 120, 143, 217]
Резюмируя вышесказанное, становится очевидной необходимость создания тест-систем детекции ОБМ и анти-ОБМ-антител в биологических жидкостях человека
Специфичность иммуноферментных тест-систем обуславливается, прежде всего, качеством препаратов антител к исследуемому антигену. Наиболее простыми с точки зрения получения и разработки метода являются поликлональные антитела, которые получают путем иммунизации животных высокоочищенными препаратами антигенов Поликлональные антитела представляют собой комплекс различных иммуноглобулинов, специ-

В качестве носителя мы использовали Toyopearl HW-50 Fine («TSK», Japan). Калибровка колонки проводилась с помощью белковых стандартов фирмы «Sigma» (USA). Процедура выполнялась в колонке фирмы «LKB» (Sweden). Детекция ОБМ, элюированного с носителя проводилась иммунохимически Условия проведения процедуры изложены в главе 3.
Аффинная хроматография.
Метод основан на избирательном взаимодействии белков, подлежащих фракционированию, со специфическими лигандами, иммобилизованными на носителе [8].
Иммуноаффинная хроматография нами проводилась для получения препаратов ан-ти-ОБМ-антител на следующих этапах
- получения поликлональных анти-ОБМ-АТ из моноспецифических кроличьих АС,
- получения моноклональных анти-ОБМ-АТ из асцитической жидкости мышей
- получения поликлональных анти-ОБМ-АТ из сыворотки больных рассеянным склерозом, забор которой проводился в стадии обострения
В качестве матрицы применяли активированную бромцианом сефарозу - CNBr-сефарозу 4В («Pharmacia Biotech», Sweden) ОБМ, выделенный согласно приведенному выше протоколу, «сшивали» с носителем по общеизвестной методике Weir D [280], в модификации Чехонина В П [13], подробное изложение процедуры имобилизации приводится в главе
Работа, связанная с проведением аффинной хроматографии выполнялась нами с использованием комплекта хроматографической аппаратуры фирмы «LKB», Sweden Условия ее проведения изложены в главе 4 Диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).
Диск - электрофоретический анализ был разработана и детально описана ürnslem !.. [201] и Davis B.J. [75]. В своей работе мы применяли аналитический вариант диск-электрофореза в 7,5 % ПААГ
Данная методика использовалась нами для оценки степени чистоты препарата ОБМ, получаемого на различных этапах фракционирования
Для определения соответствующих белковых зон столбики геля извлекали из трубочек, фиксировали в течение 30 минут в 12,5 % трихлоруксусной кислоте, а затем окрашивали в 0,2 % растворе Кумасси R-250 в течение 12 часов Отмывку от избытка краски и хранение, полученных образцов проводили в 7 % уксусной кислоте.
Для иммунохимической верификации белковые зоны иммунопроявляли С этой целью столбики геля разрезали в поперечном направлении, получая фрагменты шириной