Структура и свойства малого белка теплового шока Hsp22 и его точечного мутанта, экспрессируемого при дистальной моторной нейропатии II типа

• Автор: Ким, Мария Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика семейства малых белков теплового шока
1.2. Строение малых белков теплового шока
1.3. Функции малых белков теплового шока
1.3.1. Шапероиная активность яНяр
1.3.2. Влияние БЩр на полимеризацию актина и регуляция
динамики цитоскелета
1.3.3. Участие эНяр в регуляции апоптоза
1.3.4. Роль вІВр в развитии нейродегенеративных заболеваний и катаракты
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Препаративные методы
2.1.1. Экспрессия и выделение Ньр22 дикого типа и его К141Е-мутанта
2.1.2. Выделение актина
2.2. Определение тканевого распределения Нзр22
2.3. Методы, использованные для исследования структуры I Ер22
2.3.1. Измерение кругового дихроизма
2.3.2. Гель-фильтрация
2.3.3. Нативный электрофорез
2.3.4. Использование методов химической модификации для изучения четвертичной структуры
2.3.4.1 Модификация диметилсуберимидатом (ДМС)
2.З.4.2. Образование дисульфидных связей
2.3.5.1 Іеравновесное аналитическое ультрацентрифугирование
2.4. Определение протеинкиназной активности
2.5. Методы, использованные при изучении взаимодействия Щр22 с нативным актином
2.5.1. Метод флуоресцентной спектроскопии
2.5.2 Метод ультрацентрифугирования

2.6. Методы, использованные при изучении взаимодействия Шр22 с Нзр27 и Нзр20
2.6.1. Гель-фильтрация
2.6.2. Светорассеяние
2.7. Определение шаперонной активности
2.7.1. Определение шаперонной активности с инсулином
2.7.2. Определение шаперонной активности с алкогольдегидрогеназой
2.7.3. Определение шаперонной активности с роданазой
2.7.4. Влияние I Нр22 на агрегацию денатурированного актина 52 2.8.11екоторые аналитические методы
2.8.1. Определение концентрации белка
2.8.1.1. Спектрофотометрический метод
2.8.1.2. Метод Брэдфорд
2.8.2. БОБ-Электрофорез в ПААГ
2.8.3. Иммуноблоттинг
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка метода выделения рекомбинантного 1Бр22
человека из Е.СоИ
3.2. Тканевое распределение Ньр22
3.3. Структура и некоторые физико-химические свойства 1Ер22
3.3.1 ймричная и третичная структура
3.3.2 Четвертичная структура
3.3.3 Влияние pH на стабильность и структуру Нчр22 и его К.141Е-мутанта
3.4. Определение протеинкиназной активности 11ьр22
3.5. Ньр22 не ингибирует полимеризацию актина
3.6. Взаимодействие I Нр22 с другими малыми белками теплового шока
3.7. Сравнение шаперонной активности Пьр22 дикого типа
и его К141Е-мутанта
IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Выделение и характеристика некоторых физико-химических
свойств Н.чр22
4.2. Протеинкиназная активность I Нр22

4.3. Взаимодействие 1Нр22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие 1Вр22 в регуляции полимеризации актина
4.4. Шаперонная активность №р22
V. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

часа) при 37° С. Полученный образец (объемом 100-150 мкл) наносили на колонку Бирегбех 200 (НД 10/30), уравновешенную буфером Д, и элюировали буфером Д со скоростью 0,5 мл/мин. Для калибровки колонки использовали следующие белки-маркеры: тироглобулин (669 кДа), ферритин (440 кДа), катапаза (240 кДа), альдолаза (158 кДа), бычий сывороточный альбумин (68 кДа), химотрипсиноген (25 кДа).
Аналогичный подход был использован для анализа взаимодействия Няр22 и ІІ5р20. Однако в связи с тем, что при гель-фильтрации на Бирегбех 200 пики этих белков практически не разделяются, мы проводили гельфильтрацию смеси Шр20 и Нер22 на колонке Бирегсіех 75 НД 10/30, позволяющей осуществлять разделение белков со сравнительно малыми молекулярными массами. Калибровку колонки йирегбех 75 осуществляли так, как это было описано ранее (см. пункт 2.4.1.).
2.6.2. Светорассеяние
С помощью метода светорассеяния исследовали образование комплексов между Ньр22 и Ияр27. При этом изучали взаимодействие как белков дикого типа, так и К141Е-муганта 1Вр22 и ЗО-мутанта Няр27. В связи с тем, что при нейтральных значениях pH исследуемые белки не образовывали прочных комплексов (см. ниже), мы исследовали взаимодействие малых белков теплового шока при слабо кислом pH. В кювете спектрофотометра смешивали 140 мкл буфера Ф2 (pH 7,5) и 140 мкл буфера БЗ, содержащего смесь №р22 или 1кр27 (или их мутантов). Конечная концентрация белков теплового шока составляла 0,2 мг/мл. После преинкубации при 37° С в течение 10 мин к пробам, находящимся в кювете спектрофотометра, добавляли 10 мкл 3,5% уксусной кислоты, что приводило к уменьшению рі I от 7,5 до 6,0. Агрегацию белка, вызванную понижением pH, регистрировали по увеличению оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре Шгоярес 3100 Рго (АшегзЬаш Віоясіепсеа). Все измерения проводили в термостатируемой кювете при 37°С. По окончании 35-40 минутной регистрации пробы центрифугировали 15 минут при 14000^ Белковый состав супернатантов и осадков анализировали методом БОБ-электрофореза в 12%-ном ПААГ. При приготовлении образцов использовали буфер без р-меркаптоэтанола. Идентификацию комплексов I Нр22 и Нкр27, сшитых Б-Б связями, проводили методом иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител, специфичных к Няр27 (см пункт 2.8.3).