Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta

• Автор: Закирова, Светлана Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика ацилаз

1.1.1. Систематика цефалоспоринацилаз

1.1.2. Г омология последовательностей цефалоспоринацилаз

1.1.3. Свойства цефалоспоринацилаз

1.1.4. Структура генов цефалоспоринацилаз

1.1.5. Процессинг АСАацилаз

1.1.6. Клонирование и гетерологичная экспрессия цефалоспоринацилаз

1.1.7. Коэкспрессия субъединиц АСАацилаз i viv

1.2. Пространственные структуры ii3

1.2.1. Конформация спейсерного пептида
1.3. Аминокислотные остатки существенные для катализа и активации фермента 7АСАацилазы
1.4. Роль а аминогруппы Мконцевого серина рсубьединицы в катализе и активации фермента САСАацилазы
1.5. Механизм и сайты автопротеолиза ОПАСАацилазы
1.6. Активный центр САСАацилазы
1.7. Методы направленной эволюции в исследовании 7АСАацилаз
1.8. Методы сайтнаправленного мутагенеза для повышения активности и стабильности цефалоспоринацилаз
1.8.1. Сайтнаправленный мутагенез поверхностных остатков для повышения стабильности фермента в щелочных условиях
1.8.2. Сайтнаправленный мутагенез ключевых остатков для повышения активности 7АСАацилаз
1.9. Белокбелковые взаимодействия
1.9.1. Классификция белокбелковых взаимодействий
1.9.2. Область межсубъединичных взаимодействий белокбелкового комплекса
1.9.3. Методы исследований белокбелковых взаимодействий
1.9.4. Виртуальное аланииовое сканирование
1 Заключение
Глава 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы
2.2. Ферменты и коммерческие наборы
2.3. Бактериальные штаммы
2.4. Бактериальные среды
2.5. ДНК манипуляции и компьютерные программы
2.6. Виртуальное аланиновое сканирование
2.7. Рекомбинантные плазмиды
2.8. Синтетические олигонуклеотиды
2.9. Конструирование векторов экспрессии
2.9.1. Конструирование вектора рБУНОЮб
2.9.2. Конструирование вектора рБ УНО7
2.9.3.Конструирование вектора рБУНН
2.9.4. Конструирование векторов рБ УНСт и рБУ НО 8
2.9.5. Консгруирование вектора экспрессии рМТУ 1
2.9.6. Конструирование вектора экспрессии рМТУЗ
2 Ферментативные методы
2 Очистка гибридных вариантов С АСАацилазы
. Очистка гибридного белка ВгЮ1АСЫЗО
. Очистка гибридного белка ВгсЮ1 АН
. Очистка гибридного белка ВгсЮ1АЫтСЬВО
. Экспрессия и очистка рекомбинантных С1АН и СЬВйа.
. Выделение 3субъединицы ОПАСАацилазы
2 Рснатурация О1АН и рсубъединицы САСАацилазы
2 Определение зависимости активности САСАацилазы от и действия денатурантов
2 Дифференциальная сканирующая калориметрия
2 Определение размера белковых молекул методом светод инам и ческого рассей вания
2 Статистическая обработка результатов
Глава 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Клонирование гена ВгсЮ1 А
3.2. Конструкция вектора для экспрессии ВгсЮ1А без сигнального пептида
3.3. Получение аналогов ВгЮ1А для аффинной очистки рекомбинантных 6Ч
ферментов
3.4. Экспрессия гибридных белков
3.5. Получение очищенных препаратов рекомбинантных аналогов ВгсЮ1А
3.5.1. Металлохелат аффинная хроматография белка ВгсЮ1АН
3.5.2. Иммобилизация белка ВгЮ1 АСИВО на хитиновом сорбенте
3.5.3. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога
3.6. Определение олигомерного состояния гибридного белка
3.7. Энзиматические свойства препаратов очищенных ферментов
3.8. Экспрессия субъединиц
3.8.1 .Реконструкция в системе i vi
3.9. Определение аминокислотных остатков, образующих область
контакта между о и рсубъединицами САСАацилазы
3 Определение аминокислотных остатков, образующих область
контакта в гетеротетрамере ОПАСАацилазы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ш
БЛАГОДАРНОСТИ , 9П
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПАСАаиилаза фермент, ацилаза глутарил7аминоцефалоспорановой кислоты синоним цефалоспорин Сацилаза
цефалоспорин ацилаза ii СПАСАацилаза vi ii 0 САСАацилаза . 0 оксидаза амнноксилот пенициллииСацилаза
глутарил7аминоцефалоспорановая кислота 7АСА 7аминоцсфалоспорановая кислота
адипил 7 7 адипил7аминоцефалоспорановая кислота
7 7 аминодезацетоксицефалоспорановая кислота
6АРА 6аминопенициллиновая кислота
глу гарил6амииопенициллиновая кислота
СРС цефалоспорин С
хитинсвязываюишй домен
фенилмсти л сульфонил фторид
цианат калия
ПЦР полимеразная цепная реакция
диизопропиофосфофлуоридат
А.к.о. аминокислотный остаток
П.н. пары нуклеотидов
ПААГ полиакриламидный гель
ВВЕДЕНИЕ


Глава 1. Роль а аминогруппы Мконцевого серина рсубьединицы в катализе и активации фермента САСАацилазы
1. Глава 2. Экспрессия и очистка рекомбинантных С1АН и СЬВйа. Глава 3. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога
3. СПАСАацилаза vi ii 0 САСАацилаза . А.к. П.н. Ацилазы глутар1ш7аминоцсфалоспораиовой кислоты САСАацилазы, НС 3. САСАацнлаза катализирует ферментативное превращение глутарил7 в 7аминоцефалоспорановую кислоту 7АСА, при котором происходит расщепление амидной связи с образованием глутарата и 7АСА Ii . Ii л. Активные ферменты являются гетеротетрамерами, состоящими из 2х а и 2х рсубъединиц, которые формируются из одноцепочечного полипептидного предшественника в результате специфического процессинга белкапредшсственника и характеризуются высокой активностью по отношению к , при низкой активности по отношению к цефалоспорину С Ii . Iii . Высокое биотехнологическое значение САСАацилаз определяет интерес к разработке эффективных и экономичных систем продукции этого фермента. В тоже время, существующие методы получения рекомбинантных САСАацилаз нельзя признать достаточно эффективными, что связано со сложной структурой предшественника и недостаточной изученностью закономерности процессинга и сборки функциональноактивного тстрамера фермента i . Необходимость освобождения иммобилизованных препаратов 3 от примесей неспецифических беталактамаз и эстераз, относительно невысокая каталитическая активность фермента, нестабильность тетрамера белка под действием мягких денатурирующих агентов, при умеренных температурах, частичная инактивация фермента под действием сшивающих агентов, осложняют получение эффективных иммобилизованных препаратов i3 i . V . Целью настоящей работы являлось создание систем экспрессии аналогов ацилазы, обеспечивающих эффективный синтез данных ферментов в клетках . Клонирование гена i3 бактерии vi ii , конструирование вариантов гена , модифицированных присоединением аффинных остатков к различным участкам кодирующей последовательности фермента. Оптимизация процессов биосинтеза созданных вариантов в штаммах Е. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога с присоединенным концевым хитинсвязывающпм доменом на хитиновых сорбентах, определение кинетических и физикохимических парамсгров очищенного фермента. Исследование закономерностей реконструкции и сборки функциональноактивной i vi с использованием изолированных рекомбинантных а и рсубъединиц. Изучение области контакта между субъединицами ОПАСАацилазы, определение относительного вклада гидрофобных и электростатических взаимодействий в поддержание четвертичной структуры тетрамера ацилазы. Важнейшим соединснисмпрсдшсственником для получения антибиотиков из семейства цефалоспоринов является 7амшюцефалоспорановая кислота 7АСА Ii , а Ii я. АСА может осуществляться либо путем химического гидролиза, требующего использования крайне токсичных соединений и специальных условий инкубации при сверхнизких температурах, либо за счет энзиматического превращения i , V , , i . Известные процессы энзиматической трансформации могут быть разделены на 2 группы а одностадийные с использованием, например, цефалоспорин Сацилазы из . ВС1. Хоронснкова и Тишков, i . АСА и глутарата иод действием специфической 7Р4карбоксилбутанаминоацилазы АСАацилазы . Сдеацетилазам Ii , i , . Наибольший практический интерес для биокагалитического синтеза 7АСА представляют ферменты АС Аацилазы i , а, i . Гены 7АСАацилаз выделены из различных штаммов , разработаны системы экспрессии этих ферментов в клетках .