Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвы

• Автор: Хлынцева, Анна Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 162 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Введение
1.2. Таксономия возбудителя сибирской язвы
1.3. Эпидемиологическая характеристика сибиреязвенной
инфекции
1.4. Источники инфекции
1.5. Пути, механизмы передачи и восприимчивый организм
1.6. Роль спор B.anthracis в эпидемиологическом процессе
1.7. Микробиологическая и биохимическая характеристика
возбудителя сибирской язвы
1.8. Процесс спорообразования
1.9. Структура споры
1.10. Антигенный состав спор и вегетативных клеток
1.11. Методы детекции спор и вегетативных клеток В. anthracis
1.12. Моноклональные антитела как основа современных методов
иммуноанализа
1.12.1. Получение моноклональных антител
1.12.2. Свойства моноклональных антител
1.12.3. Области применения моноклональных антител
1.13. Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.1.2. Определение концентрации спор
2.1.3. Подготовка проб почвы и воды, искусственно зараженных
спорами микроорганизмов рода Bacillus
2.2. Получение гибридом
2.2.1. Иммунизация мышей линии ВALB/c
2.2.2. Определение уровня специфических антител у
иммунизированных мышей

2.2.3. Культивирование миеломной клеточной линии
2.2.4. Подготовка макрофагального фидерного слоя
2.2.5. Выделение спленоцитов гипериммунных мышей
2.2.6.Гибридизаци я
2.2.7. Селекция гибридных клеток
2.2.8. Скрининг гибридных клеток - продуцентов МКА
2.2.8. Клонирование гибридных клеток
2.2.9. Масштабирование гибридом
2.2.10. Культивирование гибридом in vivo
2.2.11. Криоконсервация
2.3. Выделение и очистка МКА
2.4. Характеристика моноклональных антител
2.4.1. Определение подклассовой принадлежности МКА
2.4.2. Определение молекулярной массы легкой и тяжелой цепей 65 МКА
2.4.3. Определение аффинности МКА
2.4.4. Определение специфичности МКА
2.4.4.1. Дот-блот анализ
2.4.4.2. Иммуноблотинг
2.5. Конструирование иммунодиагностических тест-систем
2.5.1. Разработка тест-системы на основе иммуноферментного 67 анализа
2.5.1.1. Биотинилирование МКА
2.5.1.2. Двухсайтовый дот-блот анализ
2.5.1.3. «Сэндвич»-ИФА
2.5.2. Конструирование латексного диагностикума на основе МКА 69 для выявления спор возбудителя сибирской язвы
2.5.2.1. Иммобилизация МКА на латексных частицах
2.5.2.2. Постановка реакции латекс-агглютинации
2.5.2.3. Лиофильное высушивание латексных суспензий с 71 иммобилизованными МКА
2.5.3. Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор Bacillus anthracis на основе магнитных
частиц с иммобилизованными МКА
2.5.3.1. Получение иммунопероксидазных конъюгатов у |
сибиреязвенных
2.5.3.2. Активация магносорбента (МС)
2.5.3.3. Получение магноиммуносорбентных диагностикумов 72 (МИС)
2.5.3.4. Постановка ИФА с использованием МИС
2.6. Идентификация мишени для МКА, использованных при 73 разработке тест-систем
2.6.1. Реакция прямой иммунофлуоресценции
2.6.1.1. Приготовление флуоресцеин (ФИТЦ) - меченных МКА
2.6.1.2. Приготовление мазков бактериальных суспензий 74 препаратов спор
2.6.1.3. Проведение прямой имму но флуоресценции
2.6.2. Получение рекомбинантного белка ЕА1 В. апЖгаыз и 75 рекомбинантного Вс1А экзоспориума В. аМкгаая
2.6.2.1. Выделение ДНК
2.6.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.6.2.3. Рестрикция
2.6.2.4. Лигирование
2.6.2.5. Электротрансформация бактериальных клеток
2.6.2.6. Выделение плазмидной ДНК
2.6.2.7. Секвенирование
2.6.2.8. Получение продуцента Вс1А и ЕА1
2.6.2.9. Выделение Вс1А и ЕА1
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение и отбор наиболее перспективных клонов 79 гибридомных клеток, продуцентов МКА
3.1.1. Иммунизация
3.1.2. Получение гибридомных клонов-продуцентов МКА
3.2. Характеристика МКА
3.2.1. Определение подклассовой принадлежности МКА
3.2.2. Выделение и очистка МКА

белков гликозилирована или связана с липидами. Установлено, что экзоспориум отвечает за исключительную гидрофобность спор и, следовательно, может играть роль в адгезии. Гликозилированные белки экзоспориума могут связываться с лектинами [63].
Из экзоспориума В. аМкгаЫя было выделено несколько белков. Среди них - аланин-рацемаза, нуклеозид-гидролаза, СЫУ и ЕхбУ, ВхрВ и Вс1А [131]. Также в составе экзоспориума В. агйкгаш обнаружена аргиназа, которая может конкурировать с макрофагами за свободный аргинин, тем самым ограничивая их способность образовывать N0 и другие свободные радикалы, отрицательно воздействующие на прорастающие споры [128].
О базальном слое и связанных с ним белках известно очень мало. Базальный слой состоит из четырёх паракристаллических пластов, каждый из которых имеет гексагональную структуру [84]. В состав базального слоя входит множество белков, в том числе ВхрВ. Этот белок образует прочные ковалентные связи с Вс1А и другими белками базального слоя и ворсинок, включая ЕхвУ и СЫУ. Яхр£-мутантные штаммы не имеют ворсинок, хотя Вс1А синтезируется у них в нормальных количествах. Недостаток ВхрВ приводит к ускоренному прорастанию спор [140]. СУйУ, ЕхэУ, Со1В-1 и Со1В-2 могут быть ассоциированы с базальным слоем или внешними слоями споровой оболочки [140]. В базальный слой или в ворсинки встроены также аланин-рацемаза, супероксид-дисмутаза и инозин-уридин-нуклеозид-гидролаза. Эти ферменты, вероятно, защищают спору от активного кислорода при инфекции и подавляют преждевременное прорастание за счёт задержки герминантов.
Также в состав экзоспориума входит иммунный ингибитор белок А -1пйА. Это цинк-зависимая металлопротеаза, разрушающая белки иммунной системы. Данный белок секретируется в течение всего жизненного цикла вегетативной клетки, однако, его гомолог обнаруживают и в экзоспориуме. 1пйА - основной компонент экзоспориума В. сегет и В. а в