Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России

• Автор: Бочков, Юрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 180 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотный остаток
ВИБК - вирус инфекционного бронхита кур
ГМ - гепатит мышей
ГТЦ - гуанидинтиоцианат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ИБК - инфекционный бронхит кур
ИФА - иммуноферментный анализ
кДНК - ДНК-копия с РНК-матрицы
КЭ - куриный эмбрион
МАТ - моноклональные антитела
мРНК - матричная РНК
н.о. - нуклеотидное основание
ОРС - открытая рамка считывания
ПААГ - полиакриламидный гель
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РДП - реакция диффузионной преципитации
РИФ - реакция иммуно флюоресценции
PH - реакция нейтрализации
РНК - рибонуклеиновая кислота
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
РЗГА - реакция задержки гемагглютинации
Трис - Трис (гидроксиметил) аминометан
ТГС - трансмиссивный гастроэнтерит свиней
ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭИД50 - доза вируса, вызывающая гибель 50% инфицированных эмбрионов HVR - hyper-variable region - гипервариабельная область dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфат
SPF - specific pathogen free -свободный от специфических патогенов
ОГЛАВЛЕНИЕ
1.ВВЕДЕНИЕ
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур
2.2. Классификация возбудителя
2.3. Репликация вируса инфекционного бронхита кур
2.4. Антигенная вариабельность вируса инфекционного
бронхита кур
2.5. Изучение иммуногенных свойств пепломерного белка Б
2.6. Диагностика инфекционного бронхита кур
З.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы
3.2. Методы
3.3. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.3.1. Разработка стратегии штаммовой дифференциации вируса ИБК с использованием молекулярно-биологических методов
3.3.2. Индикация генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР
3.3.2.1. Очистка и концентрирование вируса ИБК
3.3.2.2. Разработка метода выделения РНК вируса ИБК и суммарной РНК из различных вируссодержащих материалов
3.3.2.3. Индикация генома вируса ИБК с помощью амплификации фрагмента кДНК консервативной нетранслируемой области (З’-иТЛ) методом ПЦР
3.3.3. Исследование профиля вариабельности гена Б1 вируса ИБК
и теоретический расчет праймеров для штаммовой дифференциации
3.3.4. Амплификация кДНК вариабельной области гена Б1 методом ПЦР
3.3.5. Секвенирование вариабельной области гена Б1
3.3.6. Анализ генетической вариабельности вируса ИБК

3.3.7. Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена Б1 изолятов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России в 1997-1998 гг
3.3.7.1. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка Б1 изолятов, близких к Массачусеттской генетической
группе
3.3.7.2. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка Б1 “вариантных” изолятов, имеющих низкий уровень генетической гомологии со всеми зарубежными штаммами
вируса ИБК
4.3АКЛЮЧЕНИЕ
5.ВЫВОД Ы
6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
7.ПРИЛОЖЕНИ Я

смотря на то. что эти штаммы были выделены в течении 30-летнего периода в Европе и США они отличались не более чем на 4% по нуклеотидным и на 6% по аминокислотным последовательностям, причем около 1/3 из 32 аминокислотных отличий в белке S1 были сосредоточены в 2-х гипервариа-бельных областях (HVR 1 и 2). Аминокислотная вариабельность в HVR 1 и 2 составляла 29% и 40% соответственно.
Niesters [137J показал, что несколько изолятов вируса ИБК, серологически неродственных Mass и выделенных в Нидерландах в 1970-е гг. отличались по нуклеотидным последовательностям гена S1 более чем на 50% (D1466, VI397), тогда как отдельные пары штаммов из разных серотипов отличались менее чем на 2%. Эти данные свидетельствуют о том, небольшое число критических аминокислотных замен может приводить к изменению серотипа, и вместе с тем, штаммы ИБК принадлежащие к одному серотипу могут иметь большое количество аминокислотных отличий в HVR 1 и 2 (например D1466 и D212 имеют 22 из 30 аминокислотных отличий в HVR 1 и 2). Эти данные, также, свидетельствуют о том, что а.о. вне этих двух областей тоже вовлекаются в эпитопы, индуцирующие нейтрализующие антитела.
По данным Cavanagh и соавт. [48] из 32 позиций в гене S1 где были выявлены аминокислотные отличия между штаммами серотипа Mass, 19 были сосредоточены в первых 113 а.о. в N-концевой части S1, т.е. частота замен была в 5 раз выше, чем в остальной части S1. Одно лишь наличие гипервариабельных областей еще не доказывает, что они являются иммуногенными. Однако, секвенирование двух вариантов М41, которые не нейтрализовывались двумя МАТ (А 13 и А38) к белку S1 показало, что они имели одинаковую замену пролина 45 на гистидин, находящегося в HVR1. Эти данные указывают на то, что аминокислоты в HVR1 участвуют в образовании эпитопов, вызывающих синтез нейтрализующих антител.
Niesters и соавт. [138] получили панель из 16 МАТ к пепломерному белку S1 штамма М41. Методы конкурентного связывания позволили выявить 5 эпитопов, обозначенных А, В, С, D и Е из которых эпитопы А и В были перекрывающиеся. Связывание МАТ13 (эпитоп Е) могло усиливаться при добавлении МАТ из групп В, С и Д. Только эпитоп Е был вовлечен в