Разработка методов диагностики болезней и технологического контроля биопрепаратов на основе моноклональных антител при чуме, парвовирусном энтерите и аденовирусном гепатите плотоядных

• Автор: Черняева, Ирина Станиславовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 180 с. : ил.

Оглавление

1. Оглавление
1. Оглавление
2. Список сокращений
3. Аннотация
4. Введение
5. Обзор литературы
5.1 Чума плотоядных (чума собак)
5.1.1 История изучения
5.1.2 Характеристика этиологического агента
5.1.3 Эпизоотология
5.1.4 Клиническая дигностика
5:1.5 Лабораторная, диагностика
5.1.5.1 Гематология и исследование цереброспинальной жидкости
5.1.5.2 Биохимия
5.1.5.3 Серология и вирусовыделение
5.2 Инфекционный (аденовирусный) гепатит плотоядных
5.2.1 И апория изучения
5.2.2 Характеристика этиологического агента
5.2.3 Эпизоотология,
5.2.4 Клиническая диагностика
5.2.5 Серологическая диагностика
5.2.6 Респираторные аденовирозы плотоядных
5.3 Парвовирусы плотоядных
5.3.1 История изучения парвовирусов плотоядных
5.3.2 Характеристика возбудителя
5.3.3 Эпизоотология
5.3.4 Иммунитет
5.3.5 Клиническая диагностика
5.3.6 Лабораторная диагностика
5.3.6.1 Г ематология
5.3.6.2 Биохимия
5.3.6.3 Серология и вирусовыделение
5.3.7 Получение моноклональных антител и их использование в
диагностике
5.3.8 Заключение по обзору литературы
6. Собственные исследования
6.1 Материалы и методы
6.1.1 Материалы
6.1.1.1 Вирусы
6.1.1.2 Животные
6.1.1.3 Культуры клеток
Оглавление
6.1.1.4 Питательные среды и растворы
6.1.1.5 Сыворотки
6.1.1.6 Реактивы
6.1.1.7 Оборудование
6.1.2 Методы
6.1.2.1 Электронная микроскопия
6.1.2.2 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом
натрия (ДСН-ПААГ)
6.1.2.3 Дот-блот анализ и вестерн-блот белков
6.1.2.4 Приготовление иммуносорбентов
6.1.2.5 Определение белка
6.1.2.6 Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации
6.1.2.7 Получение гибридом
6.1.2.8 Метод тестирования антител при выявлении гибридных
антите лопродуцентов
6.1.2.9 Определение классов и подклассов моноклональных
иммуноглобулинов
6.1.2.10 Клонирование гибридных антителопродуцентов
6.1.2.11 Криоконсервация клеток
6.1.2.12 Приготовление асцитических препаратов моноклональных
антител
6.1.2.13 Очистка МАт из асцитических жидкостей
6.1.2.14 Приготовление конъюгатов антител
6.1.2.15 Лиофилизация
6.1.2.16 Метод конкурентного анализа
6.1.2.17 Сэндвич-вариант ИФА
6.2 Результаты
6.2.1 Отработка а усовершенствование методов культивирования
вирусов
6.2 Л. 1 Динамика накопления вирусов и вирусных антигенов
6.2.1.2 Сокультивирование вируса инфекционного гепатита плотоядных, панлейкопении кошек и энтерита норок Л
6.2.1.3 Оптимизация режима выращивания вируса ПЛК в культуре
клеток ФК
6.2.1.4 Освежение и препаративное накопление на норках возбудителя
парвовирусного энтерита, штамм Родники
6.2.1.5 Накопление вируса панлейкопении кошек на культуре клеток ФК
6.2.1.6 Накопление вируса чумы плотоядных на культуре клеток СУ
6.2.2 Отработка, усовершенствование и использование методов
концентрирования и очистки вирусов
6.2.2.1 Очистка и концентрирование вируса чумы плотоядных
6.2.2.2 Очистка и концентрирование вирусов энтерита и гепатита
плотоядных
Оглавление

6.2.2.3 Отработка методов иммунизации мышей BALB/'c с антигенами
вирусов панлейкопении кошек, чумы и гепатита плотоядных
6.2.3 Получение, скрининг и первичная характеристика гибридных
продуцентов моноклональных антител к вирусным антигенам
6.2.4 Разработка методов выявления и количественного определения
вирусных антигенов и специфичных к ним поликлональных антител
6.2.4.1 Сравнительная оценка активности и специфичности вариантов
серологических реакций на основе моноклональных антител для диагностики парвовирусного энтерита, чумы и гепатита плотоядных
6.2.4.2 Определение активности и специфичности моноклональных
антител 1В6, 5С12 и 1D8 методом иммунофлюоресценции
6.2.4.3 Отработка сэндвич - варианта ИФА на основе моноклональных
антител для выявления вирусных антигенов
6.2.4.4 Разработка тест-систем на основе моноклональных атител для выявления антител, специфичных к вирусным антигенам
7. Обсуждение
8. Выводы
9. Практические предложения
10. Список использованной литературы
11. Приложения
Обзор литературы

Большинство представителей рода парвовирус агглютинируют эритроциты многих видов животных. Гемагглютинация обычно протекает при температуре 4°, 20° и 37°С в широком диапазоне pH (6,6-8,5). Спонтанной элюции не происходит в течение 60 минут при 37° - 40°С. Однако при ресуспендировании агглютинированных эритроцитов в щелочном буфере при pH 9,0 вирусы полностью элюируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Освободившиеся эритроциты сохраняют способность повторно реагировать со свежим вирусом без ослабления гемагглютинируюгцей активности, так как в процессе элюции рецепторы, вероятно, не разрушаются.
Характерные особенности структуры парвовирусов делают их жизнеспособными в окружающей среде в течение длительных временных интервалов, например, при комнатной температуре вирус переживает в течение года, он хорошо сохраняется и при повышенных температурах, инактивируясь при 56°С в течение 30 минут. Термостабильность некоторых штаммов СПВ-2 еще выше: они переживают в течение 2 часов при температуре 56°С и 15 минут при температуре 80°С [334].Устойчивость их к липидорастворителям делает невозможной проведение дезинфекции спиртом, эфиром, хлороформом.
5.3.3 Эпизоотология
Вирус ГОЖ может вызывать болезнь у всех членов семейства Бейс!ас. Некоторые представители семейств Ргосуошбае и МтЫеНбае, включая енотов и норок, также восприимчивы. Некоторые штаммы вируса ПЛК патогенны для собак, большинство штаммов вируса ПЛК способны к репродукции в организме собак и остальных животных семейства Сашбае, на чем основано применение адаптированных к культуре клеток вариантов этого вируса в качестве живой вакцины против парвовирусного энтерита собак [116, 135, 223].
СААВ широко распространен в популяциях различных представителей семейства Сашбае, диких и промышленно разводимых лис. Возможно он отягощает течение аденовирусного гепатита у этих животных, однако имеет ли он самостоятельное значение в формировании какой-либо патологии неизвестно.
СГТВ-1 часто выделяется из фекалий клинически здоровых взрослых собак, причем его содержание в фекальных массах достигает 109 вирионов на грамм, что свидетельствует об интенсивной репродукции вируса в клетках кишечного эпителия, но, очевидно, репарационные способности эпителия кишечника взрослых собак превышают патогенное действие на него вируса. Считается, таким образом, что данный вирус не патогенен для взрослых жи-