Синтез РНК в семядолях гороха на ранних стадиях прорастания

• Автор: Ахматова, Айгуль Токтосуновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 c. : ил

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА РНК В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материал
2. Условия прорастания
3. Определение поглощения воды
4. Постановка опытов с мечеными предшественниками
5. Обработка меченых семядолей
6. Определение радиоактивности в ТХУ-осаждаемом и ТХУ-растворимом материале
7. Дифференциальное центрифугирование гомогената и выделение рибосом
8. Седиментационный анализ рибосом в сахарозном градиенте
9. Определение кислотонерастворимой радиоактивности
во фракциях сахарозного градиента
10. Анализ рибосом в градиенте плотности СбС1
11. ДСН-диск-электрофорез в полиакриламидном геле и радиоавтография
12. Определение содержания белка
13. Определение содержания РНК
14. Выделение рибосомных белков
15. Фракционирование РНК рибосомной фракции методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. Исследование условий и времени возобновления синтеза РНК в семядолях набухающих зародышей гороха
1.1. Выбор экспериментального материала для исследования синтеза РНК на начальных стадиях набухания

1.2. Использование меченого уридина для регистрации синтеза РНК
1.3. Условия и время обнаружения синтеза РЖ
2. Характеристика цитоплазматической высокомолекулярной РЖ, синтезированной на ранних стадиях прорастания
2.1. Локализация вновь синтезированной РЖ
в цитоплазме
2.2. Характеристика полисомосвязанной новообразованной РЖ
2.2.1. Идентификация новообразованной мРЖ
в рибосомнок фракции семядолей
2.2.2. Идентификация новообразованной рРЖ
в рибосомной фракции семядолей
2.2.3. Корреляция синтеза рРЖ и
рибосомных белков
3. Связь транскрипции и трансляции в клетках семядолей
на ранних стадиях прорастания
3.1. Зависимость транскрипции от трансляции
3.2. Роль транскрипции в раннем синтезе белка
в семядолях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Прорастание семян - сложный биологический процесс, в результате которого зародыш превращается в активно растущий и развивающийся организм.Совокупность и последовательность всех молекулярных событий, делающих возможным прорастание семени, все еще остаются неизвестными. Фундаментальная перестройка метаболизма, происходящая при прорастании, подразумевает изменения в соотношении активированных и репрессированных генов, изменения в качестве и количестве транслируемых мРНК и синтезируемых белков. Происходят ли эти изменения в активности генов во время самого набухания зародыша или же совершаются в период эмбрионального развития, а новая информация, предназначенная для перестройки метаболизма, сохраняется нереализованной в сухих семенах и затем используется при прорастании - пока не вполне ясно. Неизвестно также, различаются ли в этом отношении растущие и запасающие ткани зародыша. Все современные данные, полученные, главным образом, на растущих частях зародыша, говорят о том, что транскрипция при прорастании возобновляется очень рано и что на начальных этапах в зародыше наряду с преформированными мРНК функционируют и новообразованные мРНК. Характер их взаимоотношений и роль в синтезе белка и в прорастании все еще остаются неясными. Для решения этих актуальных задач необходимо детальное и всеотороннее исследование белково-нуклеинового метаболизма на ранних этапах прорастания. С другой стороны, прорастание представляет собой критическую стадию в жизненном цикле растения, и такие показатели.качества семян, как их жизнеспособность и сила, коррелируют со скоростью синтеза белка и РНК в начальный период прорастания. Очевидно, что для понимания молекулярных механизмов ухудшения качества семян необходимы сведения о закономерностях развития трансляционной и транскрипционной актив-

обработке ДСН, проводили в линейном 5% - 20% сахарозном градиенте, приготовленном на N а-ацетатном буфере, содержащем 0,1 М N аС1 (10 мМ яа-ацетат, 100 мМ ыаС1, pH 5,1). Анализируемые препараты суспендировали в указанном буфере или же в буфере Б, к осветленной суспензии добавляли 1/10 объема 10% ДСН и через 15 минут наслаивали на градиент. Центрифугировали 3,5 часа при 45 000 - 42 000 об/мин.
9. Определение кислотонерастворимой радиоактивности
во фракциях сахарозного градиента
Все градиенты, содержащие меченный %-уридином материал, обрабатывали на холоду. Пробирки для сбора фракций помещали в ледяную баню. К каждой фракции в 0,2 мл добавляли 3 мл бидистиллированной воды, измеряли поглощение при 260 нм, добавляли сывороточный альбумин по 0,1 мг и холодную ЇХУ до конечной концентрации 7%. Через 30-60 минут осадки отфильтровывали через нитроцеллюлозные фильтры "Оынпор" (ЧССР) № 2 (диаметр пор 2,5 мкм), промывали 2 раза холодной 7% ТХУ, фильтры подсушивали при 80° для удаления ТХУ и просчитывали в сцин-тилляционном счетчике. Если в градиенте фракционировали материал, меченный 14С-аминокислотами, то пробы перед фильтрацией прогревали 10 минут при 90°, в остальном обрабатывали как описано выше.
10. Анализ рибосом в градиенте плотности СвСІ
Анализируемый материал суспендировали в ТЭА-стандартном буфере В (20 мМ ТЭА-НС1, pH 7,2; 50 мМ КСІ, 5 мМ М& -ацетат), фиксировали А% формальдегидом при комнатной температуре не менее 48 часов. Центрифугирование проводили в преформированнои линейном градиенте СєСІ в роторе бїї -50, как описано в работах ранее (Чумикина, 1974; Гумилевская и др., 1972). Для создания градиента плотности С вСІ в
— О
пределах 1,65 - 1,30 г/см использовали 2,5 мл 51-53% раствора хлористого цезия, приготовленного на ТЭА-стандартном буфере Б, содержащем 4% формальдегид, и 2,85 мл смеси, полученной из 2 мл указан-