Рецепторные белки стрептококков : Клонирование генов, характеристика и практ. использование белков, экспрессируемых в E. coli

• Автор: Гупалова, Татьяна Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 251 с. : ил.

РОССИЙСК АЯ АКАДЕМИЯ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ
на правах рукописи
ГУПАЛОВ А ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА
РЕЦЕПТОРНЫЕ БЕЛКИ СТРЕПТОКОККОВ: КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ В Е.соїі
Специальность 03.00.04 - Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант - академик РАМН Тотолян А. А.
Санкт-Петербург / /(

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и условных обозначений
Введение
1. Литературный обзор
1.1. Общие сведения о стрептококках и их классификация
1.2. Стрептококки, как возбудители заболеваний человека
1.3 . Факторы вирулентности стрептококков группы А
1.3.1 Факторы вирулентности, ассоциированные с клеточной стенкой
1.3.2. Экстрацеллюлярные продукты
1.3.3. М белок
1.3.4. Семейство М подобных белков
1.4. Взаимодействие стрептококков с сывороточными белками человека
1.5. Иммуноглобулины: структура и функция
1.6. Альбумин: структура и функция
1.7. Бактериальные Бс-рецепторы, реагирующие с 1§0 человека и млекопитающих
1.7.1. Стафилококковый белок А
1.7.2. Связывание стрептококковыми рецепторами человека и млекопитающих
1.7.3. Стрептококковый белок О
1.8. Связывание сывороточного альбумина стрептококками групп А, С и в
1.9. Использование рецепторных белков стрептококка и необходимость создания их продуцентов

1.10. Актуальность тест-диагностических систем на основе рекомбинантных белков
1.10.1. Протеинурия. Клиническое значение микроальбуминурии
1.10.2. Метод блоттинга
1.10.3. Иммуноферментный анализ
1.11. Заключение обзора
2. Материалы и методы
2.1. Бактерии, фаги, плазмиды
2.2. Культуральные среды и условия роста
2.3. Пассирование бактериофагов
2.4. Титрование бактериофагов
2.5. Выделение ДНК из лямбдоидных фагов
2.6. Выделение плазмидной ДНК из стрептококков
2.7. Выделение плазмидной ДНК из E.coli
2.8. Выделение хромосомной ДНК из стрептококков
2.9. Рестрикция и лигирование ДНК
2.10. Трансформация стрептококков группы Н
2.11. Трансформация E.coli
2.12. Упаковка фаговой ДНК in vitro
2.13. Ультразвуковая дезинтеграция стрептококков
2.14. Электрофорез ДНК
2.15. Элюция фрагментов ДНК из гелей
2.16. Гибридизация фаговых бляшек и бактериальных колоний
2.17. Гибридизационный анализ ДНК
2.18. Секвенирование ДНК

ей различных генов и принадлежат двум различным белкам [2, 7]. Сейчас появились первые работы по клонированию гена фактора опалесценции [299].
Почти все исследования, связанные с клонированием генов М белков стрептококков группы А, выполнены на OF’ штаммах (М5, Мб, М12, М19, М24, М3). В силу того, что OF+ и OF- штаммы стрептококков отличаются между собой вытекает необходимость большего изучения антигенных детерминант М белков OF1 штаммов стрептококка группы А.
1.3.4. Семейство М подобных белков
До недавнего времени предполагалось, что каждый вирулентный штамм стрептококка группы А экспрессирует один единственный типоспецифический фибриноген-связывающий антифагоцитарный М белок, но эти данные в настоящее время пересматриваются. Теперь уже очевидно, что гены “классических” М белков - члены большой семьи генов (emm) и что многие штаммы экспрессируют больше, чем один М подобный белок.
Давно известно, что штаммы стрептококков S. pyogenes экспрессируют Ig-связывающие белки [198], Считалось, что М белки и ig связывающие белки представляют собой отдельные группы молекул. Однако анализ нуклеотидной последовательности (секве-нирование) неожиданно показал, что гены М белка и Ig рецептора имеют высокую степень гомологии [108, 118, 144], указывающую на то, что они развивались из общего прародительского гена [144]. Белки, кодируемые этими генами, теперь считаются членами семьи М подобных белков. Некоторые белки, описанные как М белки, также показывают связывание Ig [70]. Так М белок Ml серотипа связывает все четыре подкласса человеческого IgG [81], в то время как М12 связывает IgG 3 подкласса [295]. Не возможно дифференцировать антифагоцитарный М белок, связывающий фибриноген, от М подобного Ig связывающего белка, только основываясь на данных секвенирования.