Метакрилатредуктаза Geobacter sulferreducens АМ-1 : Роль и свойства

• Автор: Микулинская, Оксана Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. НЕНАСЫЩЕННЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ -ТЕРМИНАЛЬНЫЕ АКЦЕПТОРЫ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ ЦЕПЕЙ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
1.1 Фумарат - наиболее изученный акцептор электронов
1.1.1 Организация электрон-трансггортных цепей, терминальным акцептором которых является фумарат
1.1.2 Синтез АТР в ходе “фумаратного дыхания”
1.1.3 Транспорт фумарата в клетку
1.2 Ключевой фермент “фумаратного дыхания” - фумаратредуктаза
1.2.1 Фумаратредуктаза бактерии Wolinella succinogenes
1.2.2 Фумаратредуктаза бактерии Escherichia coli
1.2.3 Фумаратредуктаза Shewanellaputrefaciens
1.3 Насыщение двойной связи в боковой цепи фенилпропеноата бактерией Acetobacterium woodii
Глава 2. ОКИСЛЕНИЕ АЦЕТАТА АНАЭРОБНЫМИ ХЕМОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ
2.1 Способы активирования ацетата для вовлечения его в метаболизм анаэробных бактерий
2.2 Окисление ацетата через цикл трикарбоновых кислот
2.2.1 Ферменты и особенности ЦТК
2.2.2 Транспорт восстановительных эквивалентов от ЦТК к терминальным акцепторам электронов
2.2.3 Анаплеротические реакции ЦТК
2.3 Окисление ацетата через СО-дегидрогеназный путь
2.3.1 СО-дегидрогеназный путь
2.3.2 Перенос восстановительных эквивалентов
от СО-дегидрогеназного пути к терминальным акцепторам ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Работа с чистой культурой ЄеоЬасіег виЦигтесІисет АМ
3.1.1 Культивирование бактерии
3.1.2 Контроль чистоты культуры
3.1.3 Определение параметров роста штамма АМ
3.2 Определение ферментативных активностей
3.2.1 Измерение активности метакрилатредуктазы
3.2.2 Определение активностей ключевых ферментов СО-дегидрогеназного пути окисления ацетата
3.2.3 Измерение активностей ферментов ЦТК
3.2.4 Определение активностей ферментов, участвующих в переносе восстановительных эквивалентов от ЦТК
к метакрилату
3.3 Препаративные процедуры
3.3.1 Подготовка суспензии клеток
3.3.2 Получение грубого экстракта
3.3.3 Получение фракции периплазматических белков
3.3.4 Фракционирование сульфатом аммония
3.3.5 Хроматография на гидроксиапатите
3.4 Аналитические процедуры
3.4.1 Определение концентрации и типа флавина.
Разрушение флавинов
3.4.2 Определение содержания цитохромов с в различных препаратах и количества гемов цитохрома с (30 кДа)
3.4.3 Определение количества Бе
3.4.4 Экстракция и определение типа хинонов
3.4.5 Электрофорез в денатурирующих условиях
3.4.6 Обнаружение цитохрома с в полиакриламидных гелях
после I )8-Иа-электорофореза
3.4.7 Определение аминокислотной последовательности К-конца
3.4.8 Определение количества белка

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Ацетат является одним из наиболее распространенных компонентов в трофической цепи анаэробных консорциумов микроорганизмов. Он образуется в виде конечного метаболита в результате жизнедеятельности ацетогенной микрофлоры, включающей обширный спектр бактериальных микроорганизмов. Образованный ацетат потребляется многими аэробными и анаэробными микроорганизмами, способными использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. С точки зрения донорно-акцепторных свойств процесса, утилизация ацетата строго анаэробными бактериями осуществляется при сопряженном восстановлении либо неорганических акцепторов, таких как С02, S042’, S032', S2032-, S3062-, S°, N03", NO,', Se042“, Se032', Fe3+, Co3+, Mn4+, U4+, Ass+, либо органических акцепторов, таких как фумарат (Lovley et al., 1988, 1993; Масу et al., 1989, 1993, 1996; Thauer et al., 1989). При этом, если окисление ацетата, сопряженное с восстановлением неорганических акцепторов электронов, достаточно широко представлено среди бактериальных организмов, то использование органических акцепторов электронов при сопряжённом окислении ацетата показано только для Desulfuromonas acetoxidans и Geobacter sulfurreducens (Pfennig and Biebl, 1976; Caccavo et al., 1994), которые восстанавливают фумарат до сукцината. Однако D.acetoxidans и G. sulfurreducens, восстанавливая органические вещества, окисляют ацетат неполностью, так как фумарат в данном случае является одновременно и промежуточным продуктом дегидрирования ацетата, и терминальным акцептором электронов.
Единственным организмом, способным использовать органическое соединение в качестве конечного акцептора восстановительных эквивалентов с одновременным полным окислением органического вещества, является А-

мембраносвязанными ферментами (Spormann and Thauer, 1989). Возможно, метилен-тетрагидрофолатредуктаза связана с менахиноном, который обнаружен в мембране (Thauer et ah, 1989). Физиологические акцепторы восстановительных эквивалентов для СО-дегидрогеназы и формиат-дегидрогеназы пока не найдены.
(-432 мВ) НСОО' Метилен-тетрагидрофолат (-295 мВ)
NADH (-320 мВ)

(-117 мВ) Метил-тетрагидрофолат
СО (-524 мВ)
-► ДЦн+
(-105 мВ) 80з2’ АР8 (-60 мВ)
Рис.7. Путь переноса электронов от интермедиатов СО-дегидрогеназного пути к терминальным акцепторам электронов АРБ и 8032’ у Оеті/оіотасиїит асеїохісіат. Жирные стрелки - реакции, катализируемые мембранными ферментами. -> Дегенерация электрохимического потенциала ионов водорода. X -неидентифицированный переносчик (ТЪаиег, 1988).
Как и в других сульфат-восстанавливающих бактериях, восстановление сульфата в Н28 в D.acetoxidans происходит через АР8 и сульфит. Эта бактерия содержит АР8-редуктазу и сульфитредуктазу, которые являются растворимыми ферментами, но должны каким-то образом реагировать с мембраносвязанными дегидрогеназами. Реакции запасания энергии пока не известны (Ткаиег еі. а1., 1989).