Экзополифосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Кулаковская, Татьяна Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 204 с. : ил

Оглавление
Введение 4 "
Актуальность проблемы 4'
Состояние вопроса, цель и задачи исследования
Научная новизна работы 7'
Практическая значимость работы
Апробация работы
Публикации
Благодарности
Часть 1. Обзор литературы. Неорганические ю-бо
полифосфаты: локализация, функции, ферменты метаболизма.
Глава 1. Полифосфаты у прокариот
1.1. Локализация в клетке
1.2. Функции полиРу прокариот
1.2.1. Резерв фосфата
1.2.2. Участие в процессах запасания и использования энергии
1.2.3. Сохранение в связанной форме и детоксикация катионов 19-21 металлов.
1.2.4. Участие в формировании структуры и функции клеточной 21-22 оболочки.
1.2.5. Участие в формировании мембранных каналов и транспорте.
1.2.6. Регуляция активностей ферментов.
1.2.7. Регуляция экспрессии генов, адаптация к стационарной фазе и 23-26 стрессовым условиям.

Глава 2. Полифосфаты у низших эукариот.
2.1. Локализация в клетке
2.2. Функции полиР у низших эукариот
2.2.1.Резерв фосфата
2.2.2. Участие в биоэнергетических процессах
2.2.3. Участие в запасании и связывании катионов.
2.2.4. Формирование и функционирование клеточной оболочки
2.2.5. Регуля1(ия активности ферментов. 3
2.2.6. Участие в регуляции активности генов и обеспечении 34-36 выживания в стрессовых условиях.
Г лава 3. Полифосфаты у высших эукариот.

Глава 4. Ферменты обмена неорганических полифосфатов 41.
прокариот и эукариот.
Глава 5. О компартмент-специфичности ферментов и
эволюционном происхождении эукариотической клетки.
Часть 2. Материал и методы исследования. 61- п
1. Объект исследования
2. Получение фракций клеточных органелл и цитозоля
2. /. Получение сферотастов из дрожжевых клеток
2.2. Фракция цитозоля.
2.3. Вакуоли
2.4. Вакуолярные мембраны и вакуолярный сок.
2.5. Ядра
2.6. Митохондрии
2.7. Получение растворимой фракции митохондрий и 68 митохондриальных мембран.
2.8. Солюбилизация белков мембранной фракции митохондрий
3. Характеристика полученных субклеточных фракций по 69-70 активностям маркерных ферментов.
4. Очистка полифосфатаз из препаратов субклеточных фракций
4.1. Очистка полифосфатазы из фракции цитозоля
4.2. Очистка полифосфатазы из вакуолярного сока.
4.3. Очистка полифосфатазы из растворимой фракции 72 митохондрий.
4.4. Определение молекулярных масс полифосфатаз
5. Определение фосфогидролазных активностей
6. Определение белка
7. Очистка полифосфатов от примесей ортофосфата и 75 пирофосфата.
8. Определение ортофосфата
9. Получение антител.
10. Электрофорез белков. ?
11. Иммуноблоттинг белков
12. Определение АрН и Ем.
13. Опыты по транспорту радиоактивных субстратов.
Часть 3. Результаты и их обсуждение. 7s-i7i
Характеристика экзополифосфатаз различных компартментов клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Глава 1. Обнаружение полифосфатазных активностей в 78_
препаратах субклеточных фракций дрожжей S. cerevisiae.
Глава 2. Цитозоль.

2.1. Некоторые свойства полифосфатазной активности фракции цитозоля Ж сегепвіае.
2.2. Аденозин-5'-тетрафосфат и гуанозин-5'-тетрафосфат -субстраты экзополифосфатазы цитозоля дрожжей Ж сегегіхіае.
2.3. Очистка полифосфатазы из фракции цитозоля Ж сегестае.
2.4. Свойства очищенной полифосфатазы цитозоля.
Глава 3. Вакуоли.
3.1. Характеристика препарата изолированных вакуолей дрожжей
5. сегегівіае: транспортные системы, их свойства и механизмы.
3.2. Фосфогидролазы вакуолей Ж сегес'тае: локализация и влияние некоторых ингибиторов.
3.3. Сравнение свойств полифосфатазных активностей вакуолярного сока и тонопласта
3.4. Очистка и характеристика экзополифосфатазы вакуолярного сока.
Глава 4. Митохондрии.
4.1.Обнаружение полифосфатазной активности в митохондриях дрожжей.
4.2. Сравнение экзополифосфатазных активностей растворимой и мембранной фракций митохондрий.
4.3. Очистка экзополифосфатазы из растворимой фракции митохондрий.
Глава 5. Ядра.
5.1. Первичная характеристика фосфогидролаз ядер дрожжей Ж сегесшае.
5.2. Свойства полифосфатазной активности изолированных ядер Ж сегегівіае.
Г лава 6. Влияние условий культивирования на активность
полифосфатаз некоторых компартментов.
Заключение.
Выводы.
Список цитированной литературы.

2.2.6. Участие в регуляции активности генов и обеспечении выживания в стрессовых условиях.
Предположение об участии полиР в регуляции активности генов эукариот, основанное на тесной взаимосвязи полиР с нуклеиновыми кислотами, было высказано на основании того, что ядра ряда микроскопических грибов содержат полиР, и их содержание меняется в процессе роста и развития (Кулаев, 1975). Однако механизм этого участия остается мало изученным в силу сложности структуры клеточного ядра эукариот. Тем не менее, целый ряд фактов говорит в пользу такого представления. Так, синтез полиР в ядрах происходит одновременно с синтезом РНК (Крицкий и др., 1968; Крицкий и др., 1970; Кулаев, 1975; Kulaev and Vagabov, 1983). Обнаружено, что полиР ассоциированы с фракцией негистоновых белков (Offenbacher and Kline, 1984). Наиболее значительные изменения в полиР ядра наблюдали в процессе споруляции, который связан с включением и выключением работы больших групп генов. При этом у грибов Agaricus bisporus (Кулаев,1975; Kulaev and Vagabov, 1983) и Physarium polycephalum (Pilatus et al., 1989) наблюдался распад высокополимерных полиР на более низкополимерные фрагменты. Возможно, этот процесс осуществляла полиР - деполимераза, найденная в ядрах низших эукариот (Коношенко и др., 1972; Vagabov and Kulaev, 1983). Этот фермент, не обнаруживаемый у прокариот, расщепляет цепи полиР на более мелкие фрагменты:
ПолиР„ + Н 20-------► ПолиРп х + ПолиРх
Существуют, по-видимому, и другие механизмы участия полиР в обеспечении выживания клеток низших эукариот при неблагоприятных условиях. Так, сообщалось, что полиР важны при выживании дрожжей после радиационного повреждения в качестве альтернативного источника энергии (Holahan et al., 1988).
Имеются данные о вовлечении вакуолярных полиР в преодоление осмотического или щелочного стресса. Пик и др. (Pick et al., 1990; Pick and Weiss, 1991) показали, что у водоросли Dutmlliela salina защелачивание цитоплазмы при избытке ионов аммония в среде компенсируется массивным гидролизом полиР и высвобождением фосфата, что позволяет восстановить pH цитоплазмы. У