Очистка, физико-химические и кинетические свойства изоферментов малатдегидрогеназы из листьев ячменя и пшеницы

• Автор: Ахмад Садун Хуссейн
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 146 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Общая характеристика малатдегидрогеназной системы
1.2. Генезис и физиологическая роль МДГ в растительной клетке
1.3. Внутриклеточное распределение изоферментов малатдегидрогеназы
1.4. Физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы
1.5. Регуляция функционирования малатдегидрогеназной системы
1.6. Метаболитная регуляция МДГ
Экспериментальная часть
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Выделение клеточных органелл
2.3. Определение активности ферментов
2.4. Определение количества белка
2.5. Выделение и очистка малатдегидрогеназы
2.5.1. Экстракция
2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
2.5.3. Гель-фильтрация
2.5.4. Ионообменная хроматография
2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.7. Аналитический электрофорез
2.8. Ингибиторный анализ
2.9. Определение молекулярной массы
2.10. Аминокислотный анализ
2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных
Глава 3. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ
СОСТАВ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
ЗЛ. Изозимный спектр МДГ
3.2. Субклеточная локализация МДГ
Глава 4. ВЛИЯНИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА НА
МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ СИСТЕМУ
4.1. Динамика активности МДГ
4.2. Изоферментный состав МДГ
Глава 5. ОЧИСТКА ИЗОФЕРМЕНТОВ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И
ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
5.1. Очистка изоферментов МДГ
5.2. Аминокислотный состав изоферментов
5.3. Хранение высокоочищенных препаратов ферментов
Глава 6. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА
ИЗОФЕРМЕНТОВ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
6.1. Каталитические характеристики изоферментов МДГ
6.2. Влияние температуры на изоферменты МДГ
6.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность изоферментов МДГ
6.4: Регуляция активности изоферментов МДГ нуклеотидами
6.5. Метаболитная регуляция изоферментов МДГ
6.6. Структура активного центра МДГ и механизм его действия.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Изучение регуляции метаболических процессов является важнейшим условием развития представлений о биохимических механизмах адаптации к стрессовым условиям. Важнейшую роль в сопряжении метаболических путей растительной клетки играют органические кислоты: малат, цитрат, сукцинат и др. Данные соединения, являясь субстратами основного окислительного метаболического пути цикла трикарбоновых кислот, участвуют в формировании других биосинтетических и энергетических процессов.
Динамика содержания названных интермедиатов определяется активностью, каталитическими характеристиками, изоферментным составом и субклеточной локализацией ферментов, осуществляющих их превращения. Доминирующую роль в метаболизме малата играет малатдегидрогеназная система, включающая две оксидоредуктазы: НАД-зависимую
малатдегидрогеназу (К.Ф. ЕЕ 1.37, МДГ), и НАДФ-зависимую малатдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.82, НАДФ-МДГ) и две декарбоксилирующих малатдегидрогеназы - НАД- (К.Ф. 1.1.1.39, НАД-МЭ) и НАДФ-зависимую (К.Ф. 1.1.1.40, НАДФ-МЭ). В последнее время МДГ посвящены много разнообразных исследований. При этом, основное внимание было уделено изучению этого фермента в растениях, функционирующих в нормальных условиях внешней среды. Однако, известно, что помимо восстановления оксалоацетата до малата, МДГ выполняет важнейшую функцию в стабилизации окислительно-восстановительных процессов переноса дикарбоновых кислот через мембрану органоидов, что обуславливает ее важную роль в адаптации растительного организма х стрессовым факторам, в частности, к засолению. Особенно интересна роль изоферментов малатдегидрогеназной системы в адаптационных процессах, обеспечивающих нормальный гомеостаз растительной клетки. Для решения

чувствительным к ингибиторному влиянию АТР является митохондриальный изофермент (Glatthaor et al., 1972).
Специфичное влияние АТР на активность изоформ МДГ, возможно, служит важным звеном в механизме регуляторного сопряжения катаболических (ЦТК и др.) и анаболических (глюконеогенез и др.) процессов растительной клетки. С этой точки зрения, митохондриальная МДГ, по-видимому, является важным звеном регуляторного участка ЦТК, существующего между малатом и цитратом (Lance, Rustin, 1984), так как активность энзима внутри данного компартмента находится под строгим контролем со стороны соотношений НАДТНАДН и АТР/АДР (Tobin, Givan, 1989). Однако, несмотря на существование экспериментальных результатов, подтверждающих это предположение, большинство исследователей продолжает считать, что МДГ в ЦТК играет лишь второстепенную роль и не участвует в механизмах общей регуляции этого процесса.
Некоторые данные показывают, что для активности МДГ необходимо присутствие в растворе ионов двухвалентных металлов Mg2+ и Мп2+, которые участвуют в ее каталитическом механизме (Garrido-Pertierra et al., 1983). Однако, до сих пор не установлено, что МДГ обладает абсолютной специфичностью по отношению к одному из этих ионов. Другие авторы (Walk, Hock, 1977) указывают на наличие каталитической активности МДГ в отсутствие этих катионов в среде. Активность МДГ зависит от ионной силы среды. Высокие концентрации ионов двух и одновалентных металлов, таких как Са2+, Mg2+, Na+, К+ способны стабилизировать четвертичную структуру и повышать каталитическую эффективность отдельных изоэнзимов МДГ (Магомедов, Тищенко, 1978, Lessan: Andreopoulos, 1969). Стабилизирующее действие катионов зависит от аминокислотной последовательности МДГ. Белки микроорганизмов, обитающие в засоленных средах, имеют повышенное содержание гидрофобных аминокислот и используют высокие