Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90

• Автор: Постников, Александр Борисович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил.

Список сокращений
Обзор литературы
1. Свойства растворимой гуанилатцшслазы
1.1. Роль растворимой гуанилатциклазы в системе передачи сигнала Ж)-рГЦсОМР
1.2. Структура растворимой гуанилатциклазы и её экспрессия в
тканях
1.2.1. Изоформы растворимой гуанилатциклазы: распределение в тканях и регуляция экспрессии
1.2.2. Доменная организация растворимой гуанилатциклазы
1.2.2.1. Гем-связывающий домен
1.2.2.2. Каталитический домен
1.2.2.3. Димеризационный домен
1.3. Каталитическая активность растворимой гуанилатциклазы и способы её регуляции
1.3.1. Активация растворимой гуанилатциклазы оксидом азота (МО): роль
гемовой группы
1.3.2. Деактивация растворимой гуанилатциклазы
1.3.3. ЫО-независимые регуляторы активности растворимой гуанилатциклазы
1.3.3.1. Регуляция растворимой гуанилатциклазы порфиринами и
металлопорфиринами
1.3.3.2. Активация растворимой гуанилатциклазы полиненасыщенными
жирными кислотами
1.3.3.3. Окислительно-восстановительная регуляция активности растворимой гуанилатциклазы
1.3.4. Регуляция чувствительности растворимой гуанилатциклазы к МО в различных физиологических и патофизиологических состояниях
2. Защита белков от стрессорного повреждения. Белок теплового шока Няр90
2.1. Механизмы стрессорного повреждения белков
2.1.1. Клеточные источники активных форм кислорода и окислительный стресс
2.1.2. Окислительная модификация белков
2.1.3. Окислительная инактивация растворимой гуанилатциклазы в некоторых патологических состояниях
2.2. Белки теплового шока
2.2.1. Общие свойства белков теплового шока
2.2.2. Строение и функции Н.чр90
2.2.2.1. Внутриклеточные субстраты Нлр90
2.2.2.2. Смена белков-партнёров Нвр90 при фолдинге
2.2.2.3. Нзр90 как мишень противоопухолевых препаратов, гельданамицина и радицикола
2.2.2.4. Шаперонные свойства Нвр90
2.2.2.5. Участие Нлр90 в регуляции синтеза N0
2.2.2.6. Протекторные свойства Нлр90 при окислительном повреждении
белков
Материалы и методы
1. Реактивы и оборудование
2. Радиохимический метод определения активности рГЦ
3. Выделение рГЦ из легких свиньи
4. Реконструкция рГЦ с активирующими факторами
5. Аффинная очистка моноклональных антител к Нвр90 на колонке с иммобилизованным Нвр90

6. Изучение характеристик взаимодействия рГЦ и Нэр90 при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса
7. Изучение влияния Нвр90 на различные способы активации рГЦ в клетках линии РС
8. Коиммунопреципитация рГЦ и взаимодействующих с ней белков из ткани легких кролика. Анализ состава преципитированных комплексов рГЦ
9. Электрофорез в полиакриламидном геле
10. Иммуноблоттинг
11. Определение свободных сульфгидрильных групп при взаимодействии ДТТ или цистеина с ионами Мп2+ и Сй +
12. Определение белка по методу Лоури
13. Статистическая обработка результатов
Результаты исследования
1. Выделение из печени кролика факторов, регулирующих Мп2+-зависимук> активность рГЦ легких, и их идентификация
1.1. Экстракция и фракционирование сульфатом аммония гомогената печени
кролика
1.2. Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе
1.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Тойоперл 650М
1.4. Адсорбционная хроматография на гидроксиапатите
2. Доказательства идентичности фактора, стимулирующего Мп2+-зависимую активность рГЦ, и Нэр90
2.1. Совпадение пиков стимулирующего Мп2+-зависимую активность рГЦ фактора
и Нвр90 при хроматографической очистке фактора
2.2. Изучение влияния моноклональных антител, специфичных к нативному
Ндр90, на Мп2+-зависимую активность рГЦ в присутствии Нвр90
3. Изучение взаимодействия рГЦ и 1Ьр90 методом поверхностного плазмонного резонанса
3.1. Изучение физико-химических характеристик взаимодействия рГЦ и Нвр90
3.2. Изучение биохимических особенностей взаимодействия рГЦ и Нкр90
4. Идентификация комплексов рГЦ и Нвр90 в ткани методом
коиммунопреципитации
5. Изучение влияния №р90 на активность рГЦ в присутствии различных
регуляторов
5.1. Изучение специфичности влияния Нзр90 на активность рГЦ в сравнении с другими белками теплового шока
5.2. Изучение влияния Шр90 на МО-зависимую активность рГЦ и стабильность фермента
5.3. Изучение влияния Шр90 на различные способы активации рГЦ в клетках
линии РС
5.4. Изучение влияния №р90 на ингибирование активности рГЦ под действием МпС12иСс1С12
5.5. Изучение влияния №р90 на активность рГЦ в присутствии соединений, окисляющих атом железа в составе гемовой группы
6. Влияние Шр90 на взаимодействие рГЦ и гемовой группы
Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

Список сокращений
[Ca3+]j внутриклеточная концентрация ионов кальция
Ко равновесная константа диссоциации
К константа ингибирования
Кт константа Михаэлиса
к константа скорости реакции
ка кинетическая константа ассоциации
ki кинетическая константа диссоциации
Утш максимальная скорость ферментативной реакции
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДС-Na додецилсульфат натрия
ДТНБ 5’,5’-дитиобис(2-нитробензойная кислота)
ДТТ дитиотреитол
КЛЦМ киназа легких цепей миозина
мРНК матричная РНК
РНК рибонуклеиновая кислота
рГЦ растворимая гуанилатциклаза
Трис трис-(гидроксиметил)-метиламин
ТХУ трихлоруксусная кислота
ТЭА триэтаноламин
ФЛЦМ фосфатаза легких цепей миозина
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ФСБ фосфатный солевой буфер
ЭГТА этиленгликольтетраацетат
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ADP 5’-аденозиндифосфат
Akt протеинкиназа В
АТР 5’-аденозинтрифосфат
АХСР цитохром с' Alcaligenes xylosoxidans
BAY 41-2272 3-(4-амино-5-циклопропилпиримидин-2-ил)-1 -(2-флюоробензил)-1Нпиразоло[3,4-Ь]пиридин BAY 58-2667 4-[((4-карбоксибутил){2-[(4-фенэтилбензил)окси] фенэтил}амино)метил[бензоевая] кислота ВКса Са2+-активируемые К+-каналы высокой проводимости
Cdc37 кошаперон Hsp90, участвующий в фолдинге киназ клеточного цикла
сАМР циклический 3’,5’-аденозинмонофосфат
cGMP циклический 3’,5’-гуанозинмонофосфат
СНО клетки яичников китайского хомячка
COS клетки почек Cercopithecus aethiops
ЕС50 концентрация соединения, при которой его эффект достигает 50% от
максимального
elF эукариотический фактор инициации трансляции
F-актин фибриллярный актин
FKBP51 (52) FK506 (синтетический иммуносуппрессор)-связывающий
иммунофиллин с молекулярной массой 51 (52) кДа GroEL белок-шаперонин с молекулярной массой 60 кДа
Grp94 гомолог Hsp90 в эндоплазматическом ретикулуме
GSH глутатион восстановленный
GSSG глутатион окисленный
GTP 5’-гуанозинтрифосфат

(Коррепо1, 2001; Егса1 е! а1., 2001). Это превращение осуществляется в реакциях Фентона (3) и Габера-Вейса (4), которые происходят в присутствии ионов переходных металлов:
Н2О2 + Ре2+ —+ ОН' + ОН' + Ре3+, (3)
02" + Н202 — ОН' + ОН' + 02, (4)
Гидроксильный радикал образуется также при взаимодействии иона Ре2+ и гипохлорита (Осипов, 1993). Следовательно, если в клетке ионы переходных металлов в свободном состоянии содержатся в незначительных концентрациях, то эти реакции не будут для неё опасны.
Гидроксильный радикал инициирует перекисное окисление липидов за счет взаимодействия с жирнокислотными радикалами липидов. Замещая атом водорода в молекулах белков, гидроксильный радикал индуцирует различные оксорадикальные реакции (УояЫйа Щ а!., 2003). В результате возможна фрагментация полипептидной цепи, которая, очевидно, изменяет её свойства и функции в клетке, а также ослабляет устойчивость молекулы к протеолизу. Другим результатом оксорадикальных реакций полипептидов может быть образование кросс-сшитых молекул, которые при денатурации могут образовывать агрегаты. Гидроксильный радикал способен также повреждать ДНК, приводя к разрывам цепи полимера, к модификации дезоксирибозы или нуклеиновых оснований (ОаиЬа^, Тал, 1994). В норме в клетке существует система ловушек, блокирующих свободнорадикальные реакции. В цитоплазме эту роль выполняют аскорбат и глутатион, а в мембране — а-токоферол, убихинол и каротиноиды.
Из описанных активных форм кислорода образуются другие окислительные агенты, которые могут иметь широкий спектр воздействия, в свою очередь, принимая участие в ряде дополнительных реакций. В результате суммарного воздействия различных активных форм кислорода, окислительной модификации подвергаются все типы макромолекул клетки и многие низкомолекулярные соединения (НаШуе11, 1999). В случае снижения активности антиоксидантных систем или увеличения уровня продукции активных форм кислорода развивается состояние так называемого «окислительного стресса», результатом которого могут стать острое необратимое повреждение клетки или хронические изменения, накапливающиеся в течение всего времени существования клетки.
2.1.2. Окислительная модификация белков. Окислительное повреждение белков, в первую очередь, связывают со снижением в их составе свободных сульфгидрильных групп и падением ферментативной активности. Типичным примером постоянного повреждающего воздействия окислительной модификации являются изменения, происходящие в дифференцированных клетках стареющего организма ^асктап, 1992).