Структурно-функциональное исследование белка с молекулярной массой 45 кДа из обонятельного эпителия крысы

• Автор: Радченко, Виталий Владиславович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ФОСФОЛИПИД-ПЕРЕНОСЯЩИЕ БЕЛКИ: СТРУКТУРА И
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Часть I. Липид-переносящие белки и их биологическая роль. Липидный транспорт
1.1. Биологическое значение динамики движения липидов
1.2. Фосфолипид-переносящие белки млекопитающих, растений
и прокариот
1.2.1. РЬ-ТР, найденные в тканях млекопитающих
1.2.2. РЬ-ТР в тканях растений
1.2.3. Дрожжевые РЬ-ТР
1.2.4. Бактериальные РЬ-ТР
1.3. Специфические сайты связывания остатков жирных кислот, находящихся в
5И-7- и т-2- положениях молекулы глицерина
Часть II. Фосфатидилинозитид-переиосящие белки. Структурная организация фосфатидилинозитид-связывающих доменов. Передача сигналов и регуляция клеточных функций
1.4. Структура и лигандная специфичность фосфатидилинозит-распознающих доменов
1.4.1. Р1с11пз(3,4,5)Рз - мишень РН-домена во внутриклеточном сигнальном каскаде
1.4.2. Р1(11пз(3,4)Р2 - липидный вторичный мессенджер. Мишень некоторых РН-и РХ-доменов
1.4.3. PtdIns(3)P - ключевой фосфатидилинозит в мембранном транспорте. FYVE -распознавание и РХ-домены
1.4.4. PtdIns(4,5)P2-CBa3biBaioiinie белки и регулирование цитоскелета
1.5. SECM-домен. Белки TAP-семейства, их структура и биологические функции
1.6. Некоторые биологические функции фосфолипид-переносящих белков
1.6.1. Регуляция биосинтеза фосфатидилхолина
1.6.2. PL-TP в везикулярном транспорте
1.6.3. PL-TP и передача клеточных сигналов. Ptdlns(3,4,5)Рз - липидный
вторичный мессенджер
Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Выделение и очистка природного р45 из обонятельного
эпителия крысы
2.2. Экспрессия в клетках Escherichia coli штамма Rosetta кДНК р45 из обонятельного эпителия крысы
2.2.1. Создание генно-инженерной конструкции, обеспечивающей получение рекомбинантного р45
2.2.2. Разработка условий получения рекомбинантного р45 в прокариотической системе экспрессии
2.2.3. Очистка препарата рекомбинантного р45
2.2.4. Сопоставление характеристик природного и рекомбинантного
препаратов р45
2.2.4.1. Электрофоретический анализ
2.2Л.2. Вестерн-блоттинг

2.2.4.3. Измерение КД
2.2.4.4. Масс-спектрометрические измерения
2.3. Исследование фосфолипид-связывающей специфичности р45
2.4. Разработка нового метода изучения липид-белковых взаимодействий in vitro и применение его в исследовании р45
2.4.1. Общая схема метода
2.4.2. Взаимодействие р45 с липидными фракциями на нитроцеллюлозе
2.4.3.Масс-спектрометрические измерения липидных фракций. Подтверждение липид-связывающей специфичности р45
2.5. Экспрессия кДНК полноразмерного р45 и фрагментов кДНК, кодирующих отдельные домены, в эукариотических клетках COS
2.5.1. Изучение секреции р45 в клетках COS
2.5.2. Демонстрация совпадения внутриклеточной локализации р45 и его природного лиганда - фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата
2.6. Выявление возможных белков-кандидатов на роль биологических партнеров р45 с использованием двугибридной системы
2.6.1. Экспрессия кДНК белка р45 в клетках S. cerevisiae и ее детекция методом Вестерн-блоттинга
2.6.2. Двугибридный скрининг и анализ отобранных клонов
2.6.2.1. Наиболее вероятные партнеры белка р45
2.6.22. Белки - маловероятные партнеры белка р45
Заключение
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ)
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Бактериальные и дрожжевые штаммы и плазмидные векторы

относительное количество Р1-ТР(РС) формы. Эта последняя форма не доступна для холинфосфатцитидинтрансферазы — фермента, определяющего нормальный синтез PC. Таким образом, снова восстанавливается PI/PC отношение.
1.6.2. PL-TP в везикулярном транспорте
Роли, исполняемые фосфолипид-переносящими белками в процессе везикулярного транспорта весьма разнообразны [1,29]. Если обобщить, то можно сказать, что основное значение этих белков — транспорт различных липидов между мембранами и их обмен. Вследствие этого изменяются локальные биофизические свойства липидных слоев [4]. Возникшая неоднородность состава приводит к образованию перегибов мембран и, благодаря изменениям кривизны монослоя, формируются вторичные мембранные структуры (от тиллакоидных пластин, до мембранных пузырьков) [3,4]. На рис. 9 показана возможная модель формирования везикул и мембранных структур при участии различных типов липид-переносящих белков. Регуляция подобных процессов активно изучается в настоящее время.
Рис. 9. Предполагаемая модель образования мембранных перегибов и роли липидов и взаимодействующих с ними белков в этом прсщессе (из [4] с изменениями).