Секреция хемотактически активной D203 формы растворимого урокиназного рецептора активированного нейтрофилами человека

• Автор: Плиев, Борис Константинович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Хемотактически активные белки нейтрофилов
1.1. Классические хемокины, секретируемые нейтрофилами
1.1.1. ЕЕЯ+СХС хемокины
1.1.2. Е1Л-СХС хемокины
1.1.3. СС хемокины
1.2. Хемотактически активные белки гранул нейтрофилов
1.2.1. Кателицидины
1.2.2. Дефенсины
1.2.3. Катепсин И
1.2.4. Азуроцидин/САР37
1.2.5. Урокиназа
1.3. Участие нейтрофилов в образовании хемоаттрактантов из белков плазмы крови и интерстициальной жидкости тканей
1.3.1. Хемерин

1.3.3. ТЧАР
1.4. Хемоатграктанты нейтрофилов и формирование очага воспаления
2. Урокиназный рецептор
2.1. Мембраносвязанный урокиназный рецептор (иРАІІ)
2.2. Растворимый урокиназный рецептор (БиРАЛ)
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химические реактивы
Культуральные среды и пластик
Антитела
Мечение антител флуорохромом Аіеха Ыиог
Выделение нейтрофилов периферической крови
Культивирование клеток ЕРИЕ1/293
Активация нейтрофилов
Ферментный иммуносорбентный анализ
Анализ экспрессии антигенов методом проточной цитометрии
Сепарация фаз в Тритоне Х
Иммуноблоттинг
Дегликозилирование яиРАЛ
Анализ дегрануляции нейтрофилов
Хемотаксис
Анализ синовиальных жидкостей
Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Секреция яиРАЛ нейтрофилами, активированными иономицином
2. Секреция яиРАЛ нейтрофилами, активированными провоспалительными медиаторами
3. Доменная организация секретируемого нейтрофилами эиР АЛ
4. Хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами яиРАЛ
5. Механизм образования яиРАЛ при активации нейтрофилов
6. Секреция бцРАЛ нейтрофилами очагов острого воспаления
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Активированные нейтрофилы человека секретируют хемотактически активную 02Г)3 форму яиРАЛ
2. Секреция хемотактически активной Б2БЗ формы яиРАЛ активированными нейтрофилами человека частично опосредована катепсин в-зависимым шеддингом иРАЛ
3. Секреция хемотактически активной 02&3 формы виРАЛ активированными нейтрофилами
в очагах острого воспаления
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СХ.1-АСТ - ai-антихимотрипсин
BSA - бычий сывороточный альбумин
САР37 — катионный антимикробный белок, 37 Ша
DTPA - диэтилентриаминпентаацетат
EDTA - этилендиаминтетраацетат
FBS - эмбриональная бычья сыворотка
fMLP - N-формил-метионил-лейцил-фснилаланин
FPRL1 - рецептор, подобный формилпептидному рецептору FPR
GPI - гликозилфосфатидилинозитол
GPI-PLD — GPI-специфичная фосфолипаза D
GROa - ростовой регуляторный онкоген a
HBSS - солевой раствор Хэнкса
HNP1-4- нейтрофильные пептиды человека
IFN-y - у-интерферон
IL-8 - интерлейкин
IP-10 -у-интерферон-индуцибельный белок LPS - бактериальный липополисахарид МСР-1 - белок хемотаксиса моноцитов - 1 MFI - средняя интенсивность флуоресценции MIG - монокин, индуцируемый у-интерфероном
MIP-la(-lß, -3a, -3ß)- макрофагальный воспалительный белок — la(— lß, — За, - 3ß)
NAP-2 - активирующий нейтрофилы пептид
PAI-1 — ингибитор активаторов плазминогена
PBS - фосфатно-солевой буфер
1,10-Phth — 1,10-фенантролин
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
PNGase F -N-гликозидаза F (гликопептидаза F)
PVDF - поливинилидендифторид SDS - додецилсульфат натрия SEM - стандартная ошибка среднего

Показано, что азуроцидин связывается с неидентифицированным рецептором на поверхности моноцитов и затем иптернализуется, по-видимому, клатрин-зависимым путем эндоцитоза (Heinzelmann et al., 1998; Heinzelmann et al., 1999). Интернализовавшийся азуроцидин оказывает антиапоптотический эффект на моноциты, индуцирует экспрессию тромбоспондина и усиливает секрецию провоспалительных цитокинов TNF-a, 1L-1 и IL-6 (Ostergaard and Flodgaard, 1992; Rasmussen et al., 1996). Интересно, что азуроцидин является также хемоаттрактантом и активатором микроглии - мононуклеарных фагоцитирующих клеток центральной нервной системы (Pereira et al., 2003). Клетки микроглии, активированные азуроцидином, обнаруживают повышенную экспрессию цитокинов TNF-a, IL-ip и хемокинов, таких как фракталкин/СХзСЫ и RANTES/CCL5.
1.2.5. Урокиназа
Урокиназа, или активатор плазминогена урокиназного типа, является ключевым компонентом системы фибринолиза и играет важную роль в процессе направленной миграции клеток (Crippa, 2007). Этот белок оказывает также хемотактический эффект на многие типы клеток, включая лейкоциты неспецифического иммунного ответа. Урокиназа синтезируется эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов, эпителиальными клетками, фибробластами, моноцитами и макрофагами, а также клетками злокачественных опухолей различного происхождения. Нейтрофилы содержат внутриклеточный пул урокиназы, локализующийся во вторичных гранулах и секретирующийся при активации клеток (Granelli-Piperno et al., 1977; Heiple and Ossowski, 1986).
Урокиназа синтезируется клетками в виде одноцепочечного полипептида, состоящего из 411 аминокислотных остатков. Полифункциональность этого белка обусловлена наличием в его структуре трех доменов: N-концевого домена, гомологичного эпидермальному фактору роста (аминокислоты 1-45), центрального крингл-домена (аминокислоты 46-143) и С-концевого протеолитического домена, содержащего активный центр сериновой протеазы семейства трипсина (аминокислоты 144-411). Расщепление пептидной связи Lys 158—Ilel 59 в полипептидной цепи урокиназы переводит одноцепочечную урокиназу в двуцепочечную форму, обладающую гораздо большей протеолитической активностью.
Хемотактический эффект урокиназы обусловлен способностью N-копцевого домена этого белка взаимодействовать с урокиназным рецептором - UPAR/CD87. Этот рецептор является гликозилфосфатидилинозитол (СР1)-заякоренным белком и не имеет трансмембранного домена (см. ниже). Показано, что необходимыми адаптерными трансмембранными белками,