Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70

• Автор: Сизова, Дарья Викторовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Участки внутреннего связывания рибосомы вирусных и клеточных РНК
1.1 Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот
1.2 Внутренняя инициация трансляции
1.3 Метод поиска IRES-элементов внутри 5’-НТР мРНК
1.4 Вирусные IRES-элементы
1.4.1 IRES-элементы РНК пикорнавирусов
1.4.1.1 Структура IRES-элементов у различных пикорнавирусных РНК
1.4.1.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК пикорнавирусов
1.4.2 IRES -элементы РНК вируса гепатита С и пестивирусов
1.4.2.1 Структура IRES-элементов РНК вируса гепатита С и пестивирусов
1.4.2.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК вируса гепатита С и пестивирусов
1.4.3 IRES-элементы некоторых других вирусных РНК
1.4.3.1 IRES-элемент РНК F-MLV
1.4.3.2 IRES-элемент РНК Mo-MuLV
1.4.3.3 IRES-элемент РНК HaMSV
1.4.3.4 IRES-элемент РНКЗ IBV

1.4.3.5 IRES-элемент РНК crTMV
1.5 Клеточные IRES -элем енты
1.5.1 IRES-элемент мРНК BIP
1.5.2 IRES-элемент мРНК FGF
1.5.3 RES-элемент мРНК протоонкогена с-тус
1.5.4 IRES-элемент мРНК PDGF/с-sis
1.5.5 IRES-элемент мРНК IGFII
1.5.6 IRES-элемент мРНК VEGF
1.5.7 IRES-элементы мРНК TFID и НАР4 дрожжей
1.5.8 IRES-элемент мРНК морфогенетического фактора Antenncipedia у дрозофилы
1.5.9 IRES-элемент мРНК eIF-4G
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70
2.1 Структурно-функциональный анализ IRES-элемента

2.1.1 Локализация участка связывания eIF-З на IRES-элементе HCV
2.1.2 Исследование влияния структурных
составляющих IRES-элемента HCV на связывание с eIF-З
2.1.3 Изучение возможности одновременного связывания eIF-З и 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементом HCV
2.2 Структурно-функциональный анализ IRES-элемента
белка теплового шока HSP70

2.2.1 Исследование способности мРНК HSP 70 к внутренней инициации трансляции
2.2.2 Изучение влияния мутантного eIF-4A (R362Q) на функционирование IRES-элемента HSP
2.2.3 Сравнение эффективности функционирования IRES-элементов HSP70 и BIP
2.2.4 Определение границ IRES-элемента HSP
2.2.5 Исследование 5’-НТР и фрагмента кодирующей последовательности мРНК (3-глобина методом бицистронных конструкций
2.2.6 Структурный анализ IRES-элемента HSP
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Реактивы и материалы
3.2 Плазмидные конструкции, использованные в работе для исследования IRES-элемента HCV
3.3 Плазмидные конструкции, использованные в работе для исследования IRES-элемента HSP
3.4 Получение РНК-транскриптов
3.5 Выделение 40S рибосомных субчастиц
3.6 Выделение эукариотического фактора инициации трансляции eIF3
3.7 Анализ рибонуклеопротеидных комплексов
3.7.1 Образование рибонуклеопротеидных комплексов.
3.7.2 Мечение 5’-концов олигонуклеотидов
3.7.3 Анализ рибонуклеопротедных комплексов методом “toe-printing”
3.7.4 Обработка рибонуклеопротеидных комплексов РНКазами
3.7.5 Анализ фрагментов РНК, полученных после обработки рибонуклеопротеидных комплексов РНКазами

показана еще для ряда вирусных РНК. IRES-элементы были обнаружены у РНК F-MLV (Friend murine leukemia virus [99], Mo-MuLV (Moloney murine leukemia virus) [69], HaMSV (Harvey murine sarcoma virus) [100], трицистройной субгеномной РНК IBV (infectious bronchitis virus) [101, 102], РНК некоторых потивирусов [103, 104], CMV (cowpea mosaic virus) [105], crTMV (crucifer infecting tobamovirus) [106] и некоторых других вирусов. Для большинства перечисленных РНК была лишь продемонстрирована способность к внутренней посадке рибосомы, в то время как вопрос относительно структуры соответствующих IRES-элементов, а также взаимодействия с ними клеточных белков подлежит дальнейшему выяснению. Тем не менее, в нескольких работах были предложены модели вторичной структуры соответствующих участков внутреннего связывания рибосомы, полученные при помощи специальных компьютерных программ и мутационного анализа. Следует, однако, отметить, что экспериментальная проверка предложенных моделей методами химического и/или ферментативного зондирования была проведена лишь в случае 5’-НТР РНК MLV. Далее рассмотрено несколько конкретных примеров участков внутреннего связывания рибосомы у непикорнавирусных и непестивирусных РНК.
1.4.3.1 IRES-элемент РНК F-MLV.
Геномная ретровирусная РНК является матрицей для трансляции генов gag и pol, кодирующих предшественников структурных белков и ферментов соответственно [99]. РНК MLV, одного из представителей семейства ретровирусов, управляет синтезом двух gag-белков: Pr65gag и Pr75gIyC0'gas. Трансляция Pr65gag начинается на AUG-кодоне (позиция 619 у Friend murine leukemia virus, F-MLV), в то время как Pr75glyco"sa8 инициируется на CUG-кодоне (позиция 355 у F-MLV), расположенном в одной рамке считывания с AUGgag. Эксперименты по трансляции