Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica

• Автор: Кривошеин, Аркадий Викторович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Общие представления о структуре и функции никотинового ацетилхолинового рецептора
1.2. Изолированные субъединицы и пептидные фрагменты как модельные системы в исследованиях структуры никотинового ацетилхолинового рецептора
1.3. Изучение пространственной структуры нАХР и его
доменов/фрагментов с помощью физико-химических методов
1.3.1. Электронная микроскопия
1.3.2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)
1.3.3. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)
1.3.4. Инфракрасная (ИК-) спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (КР)
1.3.5. Спектроскопия кругового дихроизма (КД)
1.3.6. Люминесцентная спектроскопия и другие оптические методы
1.4. Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Биохимическая характеристика рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Т.californica
2.1.1. Подтверждение структуры и частичная характеристика синтетических пептидов
2.1.2. Очистка и характеристика рекомбинантных белков, включающих участки N-концевого внеклеточного домена 0£-субъединицы
2.1.2.1. Подтверждение структуры
2.1.2.2. Хроматографические и коллигативные свойства,
ренатурация
2.1.2.3. Лиганд-связывающие свойства
2.1.3. Характеристика и очистка рекомбинантного белка, включающего
участок
2.2.Вторичная структура рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Torpedo californica по данным спектроскопии КД
2.2.1. Вторичная структура фрагментов N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы
2.2.2. Вторичная структура рекомбинантного белка, представляющего основной внутриклеточный домен 6-субъединицы

2.2.3. Вторичная структура пептидов, соответствующих
трансмембранным сегментам СС-субъединицы
2.2.4. Соотнесение вторичной структуры фрагментов нАХР с вторичной
структурой интактного рецептора
2.3. Микроокружение остатков ароматических аминокислот в рекомбинантных белках СХ1-209 и §
2.4. Спектроскопическое исследование взаимодействия фрагментов
N-концевого внеклеточного домена (X-субъединицы с лигандами
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Синтетические пептиды
3.2. Рекомбинантные белки
3.3. Мембрано-связанный нАХР Torpedo californica
3.4. Препаративная офВЭЖХ
3.5. Ренатурация рекомбинантных белков (Х
3.6. Аффинная хроматография рекомбинантных белков СС1-209 на
HTII-агарозе
3.7. Ренатурация рекомбинантного белка §
3.8. Определение концентрации белков и пептидов
3.9. Электрофорез в SDS-ПААГ
3.10. Аналитическая ВЭЖХ
3.11. Масс-спектрометрия
3.12. Определение N-концевой аминокислотной последовательности
3.13. УФ-спектрофотометрия
3.14. Флюоресцентная спектроскопия
3.15. Спектроскопия КД
3.16. Анализ спектров КД
3.17. Определение связывания лигандов с рекомбинантными белками
ai-209
3.18. Химикалии, расходуемые материалы и бактериальные штаммы
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДМСО - диметилсульфоксид
ДОВ - дисперсия оптического вращения
КД - круговой дихроизм
KP - комбинационное рассеяние
м.д. - миллионные доли
МЛР - множественная линейная регрессия
МХХ - металлохелатная хроматография
нАХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор
н.о. - не определялось
н.у. - не указано
НТА - нитрилотриацетат
HTII - нейротоксин II из яда Naja naja oxiana
ß-ОГ - ß-октилглюкозид
офВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ
ПААГ -полиакриламидный гель
РСА - рентгеноструктурный анализ
у.е. - условные единицы
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ACh - ацетилхолин Аст - ацетамидометил
Вмакс ~ максимальное число участков связывания CC-Bgt - (Х-бунгаротоксин из яда Bungarus multicinctus Carb - карбамоилхолин
Cbt - кобротоксин из яда Naja naja atra
(X-Cbt - СС-кобратоксин из яда Naja naja siamensis
CH - холестерин
CHAPS - 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний-1-пропансульфонат
CPZ - хлорпромазин
Deca - декаметоний
DEPC - диэлаидоилфосфатидилхолин
DOPA - диолеилфосфатидная кислота
DOPC - диолеоилфосфатидилхолин
DTE - дитиоэритритол
DTNB - 5,5'-дитио-бис(-2-нитробензойная кислота)
DTT - дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетраацетат

Во второй работе авторы изучали вторичную структуру рецептора, реконструированного в азолектиновые везикулы. Показано, что в этой форме нАХР содержит примерно равные высокие (40-50%) доли (Х-спиралей (компонент с V 1655 см-1 ) и (3-структуры (компонент с V 1633 см-1), причём Carb в концентрациях от 10 JLIM до 1 мМ приводит к постепенному уменьшению содержания (3-структуры с одновременным появлением новой полосы при 1641 см-1, приписываемой нерегулярным структурам (см. табл.2). Исследование температурной зависимости ИК-спектров дало значение температуры "плавления" 56°С, что примерно соответствует таковому для нативных мембран (см. выше); аналогично, Carb в концентрации 1-10 мМ повышал эту температуру на
2-3°С. Динамика тепловой денатурации, определённая в этих двух работах с помощью ИК-спектроскопии, согласуется с результатами, полученными ранее этими же авторами с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии [122].
Первым количественным исследованием вторичной структуры
мембрано-связанного нАХР с помощью колебательной спектроскопии стала работа из лаборатории Hucho [123]. С помощью Фурье-ИК-спектроскопии исследовались нативные нАХР-содержащие мембраны Т.californica; для дифференциации (Х-спиральной и неупорядоченной конформаций использовались спектральные данные о полосах амид I (в Н20) и амид 1'(в D20) . Показано, что в нативном микроокружении рецептор отличается высоким содержанием регулярных структур с преобладанием (3-структуры; при этом содержание
ОС-спиральной конформации также достаточно велико (см. табл.2). Как и в предыдущих работах, была изучена температурная зависимость
ИК-спектров; полученные данные свидетельствуют в пользу двухстадийной тепловой денатурации данного белка. Первая стадия, включающая лишь небольшие структурные сдвиги, сопровождаемые постепенной потерей активности, наблюдается при повышении температуры от 20 до 30°С; вторая стадия, наблюдаемая при температурах выше 50°С, характеризуется всеобъемлющими возмущениями во вторичной структуре на фоне полной потери функциональной активности.
В развитие вышеописанной работы по изучению влияния липидного состава искусственных мембран на вторичную структуру нАХР Butler и McNamee опубликовали работу по ИК-спектроскопии в области амид I рецептора Т.californica, реконструированного в мембраны различной композиции [124]. Оцененные содержания вторичных структур (табл.2) качественно согласуются с величинами, полученными ранее в