Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства

• Автор: Хомякова, Елена Алексеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
2. ВВЕДЕНИЕ
3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВОНУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
3 Л. Химические методы исследования структуры комплексов биомолекул
3 Л Л. Фотоактивируемые производные нуклеиновых кислот
ЗЛ Л Л. Арилазидные производные нуклеиновых кислот
3 Л Л .2. Галоген- и тиосодержащие производные нуклеиновых кислот
ЗЛ.2. Образование ковалентной связи между молекулами белка и нуклеиновой кислоты с использованием формальдегида
З Л .3. Олигонуклеотиды, содержащие апуриновые/апиримидиновые сайты
3.2. Физические методы структурной биологии
3.2.1. Рентгеноструктурный анализ
3.2.2. Ядерный магнитный резонанс
3.2.3. Сравнение методов ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа для исследования НК-белковых комплексов
3.3. Исследование структурных особенностей рибонуклеазы Р
3.3.1. РНК-субъединица бактериальной рибонуклеазы Р
3.3.2. Белок бактериальной рибонуклеазы Р
3.3.3. РНК-белковые взаимодействия в бактериальной рибонуклеазе Р
3.4. Заключение
4. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2-ДИОЛЬНЫЕ, АЛЬДЕГИДНЫЕ И ГИДРАЗИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)
4.1. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2’-положении 1,2-диольные группировки
4.2. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2’-положении альдегидные группировки
4.3. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2’-положении гидразидную группировку

4.4. Физико-химические свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки 2’-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина
4.5. Влияние модифицированных звеньев, содержащих 1,2-диольную группу,
на структуру двойной спирали ДНК с использованием ферментов системы рестрикции-модификации ЬвоВ
4.5.1. Гидролиз ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2’-<9-[2-(2,3-дигидроксипропил)-амино-2-оксоэтил]уридина и 2’-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина, эндонуклеазой рестрикции ЬбоП
4.5.2. Метилирование ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2’-(9-[2-(2,3-дигидрокси-пропил)амино-2-оксоэтил]уридинаи 2!-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина, метилтрансферазой ЗбоП
4.6. Взаимодействие модифицированных олигонуклеотидов с метилтрансферазой ЬвоВ белком бактериальной рибонуклеазы Р
4.6.1. Взаимодействие метилтрансферазы ЗзоП с ДНК-дуплексами, содержащими 2’-диольную и 2’-альдегидную группировки
4.6.2. Изучение ингибирования реакции 2’-альдегидных фрагментов ДНК с метилтрансферазой ЬзоН в присутствии ДНК-конкурентов
4.6.3. Ковалентное связывание 2’-альдегидных олигонуклеотидов с белком бактериальной рибонуклеазы Р
4.7. Получение конъюгатов 2’-гидразидных олигонуклеотидов с карбонильными соединениями
4.8. Заключение
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. ПРИЛОЖЕНИЕ
1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:
АП-сайт - апуриновый/апиримидиновый сайт
АТФ - аденозин-5’-трифосфат
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДМСО - диметилсульфоксид
ДСН - додецил сульфат натрия
ДТТ - дитиотреит (трео-1,4-димеркапто-2,3-бутандиол)
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
КД - круговой дихроизм
криоЭМ - криоэлектронная микроскопия
мРНК -матричная РНК
НК - нуклеиновые кислоты
ПААГ — полиакриламидный гель
рРНК - рибосомная РНК
РСА - рентгенострукгурный анализ
ТГФ - тетрагидрофуран
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
тРНК - транспортная РНК
ТСХ - тонкослойная хроматография
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
Ас — ацетил
AdoMet - S -ад е и оз и л - L- м ет и о I mu
АМА - смесь концентрированного водного аммиака и 40% водного метиламина (1:1, v/v)
BER - эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований ВТРР - ?я/?еот-бутилимино-три(пирролидино)фосфоран Bz - бензоил
COSY - корреляционная ЯМР-спектросколия

В настоящей работе был предложен эффективный постсинтетический подход для получения 2’-гидразидных производных ДНК и РНК. Олигодезокси- (I, IV, V) и олигорибонуклеотиды (Х1У-ХУ1. XVIII), содержащие 2’-<9-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридин, обрабатывали перйодатом натрия в течение 1 ч при 25°С для получения 2’-альдегидной группировки (схема 4.5). Для последующего превращения альдегидной группы в гидразидную к 2’-альдегидным олигонуклеотидам 4.4Ь или 4.7 добавляли дигидразид янтарной кислоты в присутствии полярного апротонного растворителя диметилсульфоксида (ДМСО) и проводили реакцию при pH 4.0-4.5 в течение 18 ч при комнатной температуре. Образовавшиеся в результате реакции гидразоны 4.9 восстанавливали цианборгидридом натрия в течение 30 мин при 25°С (схема 4.5).
Схема 4

НЫ' >1 ніС
(^б Ъ—Р!26 'О-л В2б О-л. Я2б
0^он г*ц У^ У
—ОН н ІЧ-ЦН NN-N4
0^4°
нгч-ічн2 ны-ын2
4.3Ь или 4.6 4.4Ь или 4.7 4.9 4
И1, И2 = фрагменты олигодезокси- или олигорибонуклеотидных цепей.
В результате были получены 2’-гидразидные олигонуклеотиды, содержащие остатки 2’-0-(2-((2-(2-(4-гидразинил-4-оксобутаноил)гидразинил)этил)амино)-2-оксоэтокси)уридина (иь) и отличающиеся по времени удерживания от исходных олигонуклеотидов со свободной диольной группой при анализе методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 4.2). Степень превращения составляла 70-80%. Строение ряда полученных олигонуклеотидов подтверждали данными масс-спектрометрии МАЬИ-ТОР (табл. 4.2).