Картирование непрерывных В-эпитопов искусственного белка альбебетина и его биологически активных вариантов

• Автор: Бочарова, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Белки de novo: история вопроса
2.1.1. Получение искусственных белков с заданными функциями
2.1.2. Альбебетин - первый искусственный белок с уникальной топологией, не имеющий аналогов в природе
2.1.3. Активные конструкции, созданные на основе альбебетина
2.2. Происхождение и структура эпитопов
2.2.1. Иммунитет
2.2.2. Структура и функции иммуноглобулинов
2.2.3. Структура
2.2.4. Свойства В-эпитопов
2.3. Методы картирования В-эпитопов
2.3.1. Определение В-эпитопов белка на основании данных о пространственной структуре его комплекса с антителом
2.3.2. Применение точечных мутантов
2.3.3. Использование прокариотических и фаговых библиотек
2.3.4. Использование пептидных фрагментов изучаемого
белка
2.4. Использование антител в исследованиях белков
2.4.1. Антитела - инструмент для определения белков в биологических образцах
2.4.2. Применение антител для локализации
функционально важных участков белковых молекул
2.4.3. Применение антител для изучения конформации и динамики белковых молекул
2.5. Изучение иммунногенности искусственных белков
. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Реагенты
3.1.2. Оборудование и расходные материалы
3.1.3 Программное обеспечение
3.1.4 Штаммы Escherichia coli
3.1.5 Плазмиды
3.1.6 Среды для выращивания микроорганизмов
3.2. Методы
3.2.1 Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli
3.2.2 Экспрессия и выделение белков
3.2.3 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН
3.2.4 Иммунизация животных. Получение препаратов
антител
3.2.5 Определение титра антител с использованием сорбционного иммуноферментного анализа (ELISA)
3.2.6 Множественный параллельный синтез ковалентно связаных с полиэтиленовыми иглами (пинами)
гексапептидов
3.2.7 Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA) пептидов на иглах
3.2.8 Отмывка игл с пептидами после каждого ИФА
3.2.9 Статистическая обработка результатов ИФА
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Непрерывные антигенные детерминанты АВВ и конструкций на его основе, выявляемые при иммунизации кур
4.1.1. Чувствительность препаратов IgY из желтка куриных яиц и титры сывороток против ABB, ABBI и TRX-ABBI-Ins
4.1.2. Антигенные гексапептиды ABB, ABBI и слитного
белка TRX-ABBI-Ins
4.1.3. Конкурентное ингибирование ABBI и рекомбинантным ИФН-а связывания антител против ABBI с гексапептидами
4.2. Непрерывные антигенные детерминанты АВВ и
конструкцийна его основе, выявляемые при иммунизации мышей
линии BALB/c
4.2.1. Динамика иммунного ответа при иммунизации
мышей ABB, ABBI, ABBI-Ins и ABB-Ins
4.2.2 Титры IgG сывороток иммунных мышей против АВВ,
ABBI, ABBI-Ins и ABB-Ins
4.2.3 Антигенные гексапептиды ABB, ABBI, ABBI-Ins и ABB-Ins, выявляемые мышиными сыворотками и динамика специфичности иммунного ответа на ABBI-Ins
4.2.4. Конкурентное ингибирование ABB, ABBI, ABBI-Ins и рекомбинантным ИФН-а связывания антител против ABBI
и ABBI-Ins с гексапептидами
4.3. Сравнение антигенных карт искусственных белков,
полученных при использовании антител животных двух видов
4.4. Соотношение антигенной карты и пространственной структуры молекулы
4.5. Заключение по результатам эпитопного картирования
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
А.к.о. - аминокислотный остаток.
ДИК - диизопропилкарбодиимид ДМ* - N,N-диметилформамид.
ДСН - додецилсульфат натрия.
ИФА - иммуноферментный анализ.
ОБТ - 1-оксобензотриазол.
ПФФЭ - пентафторфениловые эфиры.
А405 - оптическая плотность (поглощение) при длине волны, равной 405 нм.
АВВ - альбебетин
ABB-Xns - альбебетин с фрагментом инсулина на С-конце ABBI - альбеферон (альбебетин с фрагментом IFN-a2 на N-конце) ABBI-Ins - альбебеферон с фрагментом инсулина на С-конце ABTS - 2,2'-азино-бис[З-этилбензтиазолин-6-сульфонат].
BCR - В-клеточный рецептор (В Cell Receptor), поверхностный иммуноглобулин.
CD - «кластер дифференцировки», обозначение поверхностной молекулы клеток иммунной системы согласно соответствующей классификации.
CDR - области молекулы антитела, определяющие комплементарность к антигену (Complementary Determining Regions).
Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил.
Ig - иммуноглобулин.
МНС - главный комплекс гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex), молекула - продукт главного комплекса гистосовместимости.
PBS - фосфатно-солевой буфер.
PBST - фосфатно-солевой буфер с Tween 20.
TCR - Т-клеточный рецептор (Т Cell Receptor).
Сокращенные обозначения аминокислот и соответствующих остатков в тексте используются согласно ранее опубликованного перечня [1].

Часть антител из большого набора препаратов моноклональных антител, полученных против р2-субъединицы триптофан-синтазы E.coli, не взаимодействовала с нативным белком, но реагировала с денатурированными или подвергшимися частичному протеолизу молекулами [111]. При изучении рефолдинга этого белка после денатурации гуанидином с использованием метода «остановленной струи» (stop-flow) были обнаружены моноклональные антитела, селективно связывающиеся с белком на различных этапах рефолдинга. Некоторые из этих антител препятствовали фолдингу глобулы, блокируя свои эпитопы.
Моноклональные антитела также применяются для оценки наличия конформационных изменений в генно-инженерных продуктах с точечными мутациями по сравнению с нативным белком [112]
Поскольку, как было показано ранее [97], определяемые с помощью пептидного сканирования линейные эпитопы локализованы в основном на поверхности белка, антигенное картирование белков можно было бы использовать для сравнения поверхности их молекул в нативной и денатурированной (или частично денатурированной) форме. К примеру, сопоставление антигенных карт холо- и апо-форм дигидрофолат-редуктазы выявило лишь незначительные различия между этими формами [95], что может указывать на сходство конформаций этого белка в комплексе с коферментом (NADH) и без него. Напротив, сопоставление антигенных карт холо- и апо-форм цитохрома Р4 50 2В4
продемонстрировало некоторую разницу между ними как по общему количеству, так и по локализации линейных антигенных детерминант [113]. Эти сведения позволяют локализовать участки молекулы Р450 2В4, изменяющие свою конформацию при удалении кофермента (тема).
2.5. Изучение иммунногенности искусственных белков
Хотя белки de novo изучают уже более 10 лет, иммунологические свойства их до сих пор мало изучены.