Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека

• Автор: Давыдов-Синицын, Александр Петрович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 98 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Цели и задачи исследования
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ПОНЯТИЕ О СТВОЛОВОЙ КЛЕТКЕ
Стволовые клетки кишечника млекопитающих
Эпителий кишечника млекопитающих
История исследований кишечного эпителия
Первые наблюдения стволовых клеток крипты
Молекулярные подходы к выявлению стволовых клеток
Воссоздание кишечного эпителия in vitro
Ниша стволовой клетки
Ниша стволовой клетки крипты
СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ В КИШЕЧНОЙ КРИПТЕ

PTEN/PI3K
Delta-Notch
ОПУХОЛЕВЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
Опухолеспецифические антигены
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа с клетками в культуре
Культивирование клеток
Пространственные клеточные культуры
Капъций-фосфатная трансфекция
Лентивирусная инфекция
Обработка антибиотиками и ганцикловирам in vitro
Построение кривых роста
Анализ сферообразования на низкоадгезивнам субстрате
Получение пространственных колоний
РАБОТА С ЖИВОТНЫМИ, ОРГАНАМИ И ТКАНЯМИ
Экспериментальные животные
Получение подкожных опухолей
Получение опухолей во внутренних органах
Лечение ганцикловиром in vivo
Гистологические методы
3. Молекулярные и биохимические методы
Молекулярное клонирование
Выделение геномной ДНК
Выделение РНК и обратная транскрипция
Полимеразная цепная реакция
ПЦР в реальном времени
Выделение белка и дот-гибридизация
Измерение люциферазной активности
Иммунофлюоресцентное окрашивание
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Взаимодействие белков Cdx и Ddx5 в клетках кишечного эпителия
Колокализация СсЫ2 и Ddx5 в клетках СаСо-2 и эпителии кишечника
Влияние Cdx2 и Ddx5 на активность Wnt-сигнального пути
пространственные культуры в коллагеновом гидрогеле

Построение кривых роста
Иммуноокрашивание клеток MIP
Проверка клеток MIP101 на экспрессию генов-маркеров
Активность промотора сукразы-изомальтазы в клетках MIP
Опухолеобразование и метастазирование клеток MIP
Формирование пространственных колоний
Клоногенность клеток М1Р
Туморогенность MIP
Активность Wnt-сигналинга в базовой и обогащённой популяции
Подавление РСК in vivo
ОТ-ПЦР в реальном времени на ocl
Возможные альтернативы Oct4 в стволовых клетках MIP
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
ОСК — опухолевые стволовые клетки
ОТ-ПЦР — обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
РСК — раковые стволовые клетки
СК — стволовые клетки
ЭСК — эмбриональные стволовые клетки
СВС-клетки — Crypt base columnar cells — столбчатые клетки основания крипты СЕА — Carcinoembryonic antigen — раково-эмбриональный антиген (СЕАСАМ5)
CE AR — СЕА receptor -— рецептор СЕА (hnRNPM)
НЕК — Human embryonic kidney cells — клетки эмбриональной почки человека
HBS — Hepes buffered saline — буферный раствор с Hepes
PBS — Phosphate buffered saline — фосфатный буферный раствор
PBST — PBS-Tween — PBS с добавлением 0.1 % Tween
+4-клетки — клетки крипты, расположенные в 4 клеточных диаметрах от её основания

гиперактивно ста Wnt-сигналинга, наблюдаемый в большинстве кишечных карцином на фоне недостаточности онкосупрессора АРС.
Иная картина обнаруживается при физическом удалении гена рецептора Bmp (bmprla) избирательно в эпителиальном пласте под контролем промотора виллина [Auclair et al., 2007]. Гистология опытных мышей показала ненормальную морфологию эпителия: удлинённые ворсинки и многочисленные крипты, количество которых в 1.37 раз превышало норму. В то же время не были найдены новообразованные крипты на поверхности ворсинок, и по меньшей мере в течение года у мышей не обнаруживались полипы, что противоречит ранее описанным моделям с потерей Втр-сигналинга.
Опыты по включению метки показали 1.76-кратное усиление пролиферации кишечного эпителия в мутантных мышах, причём клеточные деления происходили по всей длине крипты. Уровень апоптоза (активированной каспазы-3) оставался без существенных изменений. Уровень ядерного ß-катенина у ВтргГГ-мутантов также оставался постоянным, что указывает на отсутствие изменений в Wnt-сигналинге. Что касается мишеней Wnt-сигнального пути, то с-Мус оставался на том же уровне, тогда как Cyclin Dl заметно активировался. Известно, что Cyclin D1 регулируется не только Wnt, но и Ras/Erk-каскадами [Lavoie et al, 1996].
Нужно отметать, что в первой работе секретируемый ингибитор Noggin мог воздействовать не только на эпителиальные клетки, но и на прилежащую мезенхиму, тогда как во вторй статье эффект (удаление рецептора) распространялся исключительно на эпителиальный пласт. Таким образом подтверждается роль BMP как ингибитора пролиферации, но вместе с тем можно заключить, что для формирования крипт de novo требуется активность подлежащей мезенхимы.
Исследование клеточных типов, входящих в состав эпителия кишки, на фоне имнгибирования ВМР-сигналинга дало следующие результаты [Auclair et al., 2007]. Бокаловидные клетки у мутантов присутствовали в нормальном количестве, однако были мельче по размерам и содержали меньшее количество гранул, что указывало на их незрелость. Количественный анализ экспрессии показал сильное снижение уровня транскрипционных факторов Klf4 и ТАЗ — регуляторов дифференцировки бокаловидных клеток [Katz et al., 2002; Podolsky et al., 1993].
Клетки Панета не продемонстрировали заметных внешних изменений. Однако наблюдалось многократное (в 2—5 раз) снижение экспрессии функциональных маркеров