Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом и их матерей

• Автор: Кравец, Виктор Сергеевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Белгород
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Оглавление
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Общая характеристика аутистических расстройств,
частота аутизма
2.2. Аутизм и хромосомные аномалии
2.3. Аутизм и гетерохроматиновые варианты
2.4. Аутизм и нестабильность хромосом
2.5. Аутизм при моногенных синдромах
2.6. Поиск генов-кандидатов при аутизме
2.7. Вариации генома и аутизм
2.8. Аутистические расстройства и хромосомный мозаицизм
2.8.1. Мозаицизм и анеуплоидия аутомосом
2.8.2. Фенотипические признаки, ассоциированные с
конституциональным мозаицизмом
2.8.3. Соматическая анеуплоидия аутосом
2.9. Исследования членов семей детей с аутистическими расстройствами
2.10. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Цитогенетические методы
3.1.1. Культивирование лимфоцитов периферической крови
3.1.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер
3.1.3. G-окрашивание хромосом (GTG)
3.1.4. С-окрашивание хромосом (CBG)
3.1.5. Принципы анализа хромосомных препаратов
3.2. Молекулярно-цитогенетические методы
3.2.1. Приготовление ДНК проб - ДНК-полимеразная реакция
замещения (ник-трансляция)
3.2.2. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH)
3.2.2.1. Принцип анализа флюоресцентных сигналов после
проведения гибридизации in situ
3.2.3. Сравнительная геномная гибридизация (CGH)
3.2.4. Биоинформатический анализ
3.3. Статистическая обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Цитогенетические и молекулярно-цитогнетические исследования
в группе детей с аутизмом (I группа)
4.1.1. Численные и структурные аномалии хромосом в группе детей
с аутизмом (I группа)
4.1.2. Молекулярно-цитогенетические исследования в группе детей
с аутизмом (I группа)
4.1.3. Гетерохроматиновые варианты в группе детей с аутизмом (I группа)
4.2. Исследования хромосомного мозаицизма в группе детей
с аутизмом (11 группа)
4.3. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические
исследования в группе матерей детей с аутизмом (III группа)
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время роль генетических факторов в этиологии большой части случаев психических болезней и нарушений психоречевого и психомоторного развития не вызывает сомнения. Изучение генетических аномалий у детей при различных психических заболеваниях (заболеваниях центральной нервной системы) в настоящее время является одним из наиболее актуальных направлений в клинической генетике и биологической психиатрии. Тем не менее, определение генетических изменений, являющихся причиной таких распространенных болезней мозга, как аутистические расстройства, чаще всего остаётся невозможным, что может быть объяснено существованием множества различных факторов, способных вызывать признаки аутизма [Levy et al., 2009]. В целом среди обширного круга исследователей этой патологии господствует мнение о генетической природе большинства (или, по крайней мере, большой их части) случаев аутистических расстройств как об основной причине аутизма [Ворсанова и др., 2006; 2013].
Аутистические расстройства занимают видное место в обширном спектре психических нарушений. Клинически аутизм выражается в нарушении социальных контактов, утрате познавательной активности и последующими регрессу и распаду личности, десоциализации, инвалидизации и, в отдельных случаях, снижению интеллекта. Аутизм как симптомокомплекс встречается при многих заболеваниях с известной генетической основой, как, например, синдром Ретта. Частота аутизма значительно варьирует как в разных странах, так и по оценкам разных авторов, и составляет 5-90 на 10000 детей и подростков [Башина, 1999; Ozand et al., 2009]. В некоторых исследованиях американских авторов приводятся данные о более высокой частоте аутизма среди детей: до 1:250 и даже 1:88 (по данным Центра контроля и профилактики заболеваний [Centers for Disease Control and Prevention, 2012]. Вполне возможно, что определённый вклад в развитие аутизма вносит ухудшение экологической обстановки. Вероятно, большие группы детского населения, как в России, так и в других странах, недостаточно обследованы, и в некоторых когортах детей этот показатель может быть выше. Это особенно актуально в тех странах и среди тех социальных групп, в которых уровень как медицинского обслуживания населения вообще, так и генетического консультирования, в частности, очень низок. На уровень встречаемости аутизма также могут влиять такие экзогенные факторы, как воспитание детей и уход за ними и т.д. Очевидно, что с развитием методов диагностики и систем обследования детей с аутизмом эти показатели будут меняться в сторону увеличения. Важно отметить, что у некоторых детей признаки аутизма «маскируются» более тяжёлыми симптомами, связанными с другими патологическими проявлениями и

CNV и охват ими генов целиком могут влиять на фенотип, как и близлежащие гены. Более того, некоторые структурные варианты, оцениваемые как безвредные, при ретроспективной оценке могут быть ассоциированы с небольшими фенотипическими отклонениями [Kumar et al., 2008; Marshall et al., 2008]. Все эти влияния могут осложнить исследования заболеваний, где генетическая предрасположенность других аллелей риска может повлиять на экспрессию и пенетрантность.
De novo CNV обнаруживают в общей популяции относительно часто, иногда 2 и более на образец [Feuk et al., 2006; Marshall et al., 2012]. В одном из случаев у пациента с аутизмом обнаружены 2 аномалии - делеция в 277 тыс. пн в локусе гена SHANK3, а также крупная дупликация в 1,4 тыс. пн (охватывающая 44 гена) в участке 20ql3. Данный ген, как известно по результатам многих исследований, в том числе скрининга мутаций, есть редкий каузальный фактор аутизма; следовательно, всего более вероятно, что аутизм был вызван de novo делецией этого гена у данного пациента. Если бы делеция в данном гене осталась незамеченной, то более крупная аномалия в хромосоме 20 могла быть ошибочно ассоциирована с аутизмом (поскольку она может влиять на фенотип).
В исследовании Levy D. et al., 2011, где изучались и de novo, и унаследованные CNV при заболеваниях аутистического спектра, отмечено, что у монозиготных близнецов конкордантность отмечалась примерно в 90% случаев. Основываясь на более ранних исследованиях, авторы предположили роль de novo вариаций зародышевых клеток в т.н. простых семьях (т.е. с 1 ребёнком с аутизмом), в отличие от унаследованных вариаций, которые могут преобладать в сложных семьях (более 1 больного ребёнка в семье). Интересно, что похожие находки были и при исследованиях спорадической и наследуемой шизофрении. Анализ встречаемости пробандов мужского пола в сложных семьях позволил предположить, что многие случаи заболеваний аутистического спектра возникают из-за de novo вариантов с высокой пенетрантностью, и что некоторые такие варианты с высокой пенетрантностью передаются от асимптоматичных носителей доминантно. С целью выявления точек мутаций и изучения заболеваний аутистического спектра была изучена крупная подборка семей только с 1 ребёнком с аутизмом. Почти во всех случаях в такой семье был хотя бы 1 здоровый сибс, а сложные семьи были исключены из исследования. CNV в этих семьях исследовали с помощью array CGH с большим числом микропроб, что позволило, в теории, обнаруживать вариабельные участки меньшего размера. И делеции, и дупликации de novo внесли свой значительный вклад в формирование болезни, и число находок было больше по сравнению с платформами меньшей разрешающей способности, что позволило сделать значимую добавку в список генов-кандидатов аутизма. Данные исследования также показывают соотношение полов и ставят