Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

• Автор: Чекунова, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 338 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Основная часть
1. Обзор литературы. Генетика метаболизма хлорофиллов
1.1. Природные тетрапирролы и их производные
1.2. Хлорофиллы
1.2.1. Исторический очерк
1.2.2. Формы хлорофиллов
1.3. Г енетика биосинтеза хлорофиллов. Достижения и проблемы
1.3.1. Ферменты биосинтеза хлорофилла. Генетические исследования
1.3.1.1. Синтез АЛК
1.3.1.2. Синтез протопорфирина IX из АЛК
1.3.1.3. Магниевая ветвь биосинтеза тетрапирролов. Ранние этапы образования хлорофиллов
1.3.1.4. Заключительные стадии биосинтеза хлорофиллов
1.4. Превращения протохлорофиллида: темновой и светозависимый пути
1.4.1. Протохлорофиллид в цепи биосинтеза хлорофиллов
1.4.2. Биосинтез хлорофиллов в темноте. Г енетические исследования
1.4.3. Светозависимый биосинтез хлорофиллида
1.4.4. Эффективность биосинтеза хлорофиллов в темноте и на свету
1.4.5. Проблемы и перспективы изучения темнового биосинтеза XJ1
1.5. Катаболизм хлорофиллов
1.5.1. Образование окрашенных катаболитов хлорофиллов
1.5.2. Образование неокрашенных катаболитов
1.6. Эволюционные аспекты метаболизма хлорофиллов
1.7. Генетические аспекты световой и метаболической регуляции биосинтеза хлорофиллов
1.7.1. Регуляторные механизмы биосинтеза хлорофилла

1.7.2. Свет - регулятор экспрессии генов, кодирующих белки фотосинтеза
1.7.3. Регуляция светом. Посттрансляционный уровень
1.7.4. Белки ЕЫР регулируют уровень синтеза хлорофиллов
1.7.5. Координация экспрессии генов ядра и хлоропласта в процессе биосинтеза хлорофиллов
1.7.6. Этапы биосинтеза, существенные для механизмов регуляции
1.7.7. Механизмы обратного ингибирования синтеза хлорофилла
1.7.8. Заключение
2. Материалы и методы
2.1. Генетический материал
2.2. Условия культивирования штаммов хламидомонады
2.3. Тестирование признака — парализованные жгутики
2.4. Гибридологический анализ мейотического потомства
2.5. Определение типа спаривания
2.6. Определение размеров клеток
2.7. Мутагены и методы мутагенеза
2.8. Метод спектрофотометрии
2.9. Определение качественного и количественного состава порфиринов
2.10. Определение АЛК-синтетазной активности
2.11. Определение содержания протогема в клетках С. rein.hard.tiИ
2.12. Определение активности магний-хелатазы
2.13. Выделение и анализ нуклеиновых кислот из С. reinhardtii
2.14. Вестерн-блот анализ
2.15. Трансформация клеток методом «стеклянных шариков»
2.16. Время генерации культур
2.17. Получение автолизина
2.18. Статистическая обработка данных
2.19. Компьютерные программы и базы данных

3. Экспериментальные исследования
3.1. Генетико-биохимические исследования хлорофильных мутантов хламидомонады, накапливающих порфирины
3.1.1. Первичная характеристика мутантов
3.1.1.1. Мутанты хламидомонады, использованные в работе
3.1.1.2. Спектрофотометрия мутантов
3.1.2. Гибридологический анализ хлорофильных оранжевых мутантов
3.1.2.1. Оптимизация условий проведения скрещиваний
3.1.2.2. Анализ комплементации мутаций у ХОМ С. reinhardtii
3.1.2.3. Изучение рекомбинации мутантных аллелей в группе ХОМ
3.1.2.4. Тетрадный анализ мутантов по генам СНЫ и LTS3 С. reinhardtii
3.1.2.5. Использование анеуплоидии для картирования мутаций
3.1.3. Биохимические исследования ХОМ С. reinhardtii
3.1.3.1. Анализ пигментного состава клеток ХОМ С. reinhardtii
3.1.3.2. Активности ферментов биосинтеза хлорофилла у ХОМ С. reinhardtii
3.1.3.3. Белковые компоненты фермента магний-хелатазы у
мутантов С. reinhardtii по генам CHL1 и LTS
3.1.4. Обсуждение результатов
3.1.5. Выводы
3.2. Идентификация гена CHLH С. reinhardtii, кодирующего большую субъединицу магний-хелатазы
3.2.1. Клонирование гена CHLH. Выбор стратегии и результаты
3.2.2. Идентификация мутантный аллелей: с/г/7 и brs-l гена CHLH
3.2.3. Вестерн-блот анализ белков магний хелатазы С. reinhardtii
3.2.4. Геномная комплементация мутантного фенотипа
3.2.5. Экспрессия гена CHLHхламидомонады. Регуляция светом
3.2.6. Структурно-функциональные характеристики гена CHLH
3.2.6.1. Компьютерный анализ гена СНLH
3.2.6.2. Сравнительный анализ белка CHLH С. reinhardtii

которого вело к компенсации эффекта мутации hemA - восстановлению синтеза AJIK, содержал ген, кодирующий GluTR. Он получил название HemA [Li et al., 1989]. Этим методом геномной комплементации - по способности компенсировать мутантный фенотип штамма E.coli hemA [Pontoppidan and Kannangara, 1994], гены, гомологичные HemA, были найдены у целого ряда растений (арабидопсиса, ячменя, огурцов и др.). GluTR — ключевой фермент в регуляции биосинтеза ХЛ. Его активность ингибируется гемом и протохлорофиллидом через регуляторные белки [Srivastava et al., 2005]. Экспрессию генов, кодирующих GluTR у растений и водорослей, контролируют: свет, растительные гормоны и циркадные ритмы [McCormac et al., 2001].
Фермент глутамат-1-полуальдегидаминотрансфераза (GSA-AT).
Впервые GSA-AT был выделен из стромы хлоропластов ячменя [Grimm et al., 1989]. Вслед за установлением первичной структуры, по последовательности аминокислот этого белка были сконструированы праймеры для ГПДР-амплификации фрагмента кДНК кодирующего его гена, который послужил зондом для скрининга библиотеки кДНК. Итогом работы стало получение полной нуклеотидной последовательности гена GSAT [Grimm, 1990], которую использовали далее для поиска генов, кодирующих этот фермент у E.coli и цианобактерии Synechococcus РСС 6311 [Grimm et al., 1991 ].
К ауксотрофности по AJIK у E.coli приводят мутации в двух генах: уже упомянутом НетА, кодирующем GluTR [Säsärman et al., 1968], и HemL, который первоначально носил название РорС [Wulff, 1967]. Эксперименты по геномной комплементации мутанта рорС показали, что дефектный у него ген HemL кодирует фермент GSA-AT [Ilag et al., 1991]. В дальнейшем, его ортологи были изолированы у многих объектов [Timko, 1998].
Белок GluTR представляет собой V-образный димер, и его пространственная структура предполагает способность к образованию стабильного комплекса с молекулой GSA-AT (рис. 1.9). Модель их совместного