Протеолитический белок CPAF Chlamydia Trachomatis : характеристика биологических свойств и поиск ингибиторов

• Автор: Давыдова, Дарья Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л .Биологическая характеристика хламидий
1.2. Таксономическое положение хламидий
1.3. Генетические особенности С. trachomatis
1.4. Жизненный цикл хламидий
1.4.1. Образование хламидийных включений
1.4.2. Секретируемые факторы хламидий
1.5. Протеасомный белок С.trachomatis
1.5.1 Субстратная специфичность белка CPAF
1.5.2. Структурная характеристика белка CPAF
1.5.3. Секреция белка CPAF через Sec-зависимый путь
1.6. Ингибирование белка CPAF
1.7. Разработка антихламидийных препаратов на основе подавления
протеасомного белка
Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы, клеточные линии и плазмидные вектора
2.1.2. Реактивы для синтеза и модификации ДНК
2.1.3. Общелабораторные реагенты
2.1.4. Питательные среды
2.1.5.Буферные растворы
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.1.7. Предоставляемые материалы
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование микроорганизмов

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3.Постановка полимеразной цепной реакции
2.2.3.1. Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле
2.2.4. Молекулярное клонирование гена cpaf в Escherichia coli
2.2.5. Делегирование сигнальной последовательности в гене cpaf
2.2.6. Мутагенез гена Cpaf
2.2.1. Трансформация клеток Escherichia coli
2.2.7.1. Выделение и очистка белка из культуры E.coli
2.2.8. Трансформация клеток S. cerevisiae
2.2.8. 1. Выделение белка CPAF из культуры S. cerevisiae
2.2.9. Определение токсического фенотипа у дрожжей «drop test» методом
2.2.10. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF
2.2.11. Электрофорез в SDS - полиакриламидном геле
2.2.11.1. Окрашивание SDS - полиакриламидного геля серебром
2.2.12. Определение ферментативной активности белка CPAF
2.2. 13. Поиск ингибиторов белка CPAF методами компьютерного моделирования
2.2.14. Определение цитотоксического эффекта химических соединений методом окрашивания клеток метиленовым синим
2.2.15. Определение цитотоксического эффекта химических соединений в МТТ-тесте
2.2.16. Метод суспензионного заражения эукариотических клеток
2.2.17. Определение влияния химических соединений на внутриклеточное размножение хламидий
2.2.18. Определение ингибирующей активности низкомолекулярных соединений методом иммуноблоттинга
2.2.19. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Клонирование гена cpaf в штаммы E. coli и выделение активного белка CPAF
3.2. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку

3.3. Получение рекомбинантного белка CPAF в биологически активной
форме
3.4. Оценка ферментативной активности белка CPAF
3.5. Клонирование гена cpaf в Saccharomyces cerevisiae
3.5.1. Изучение токсического эффекта CPAF с использованием
S.cerevisiae
3.5.2. Получение вариантов дрожжей с повышенной устойчивостью к действию CPAF
3.6. Выбор химических соединений - ингибиторов CPAF на основе виртуального скрининга
3.6.1. Изучение токсичности химических соединений на основе стандартных токсикологических тестов
3.6.2. Изучение влияния химических соединений на развитие хламидийной инфекции в культуре клеток
3.6.3. Изучение влияния химических соединений на протеолитическую активность белка CPAF
3.7. Экспериментальное тестирование структурных аналогов выбранных ингибиторов белка CPAF
3.7.1. Оценка токсичности новых синтезированных соединений с использованием метиленового синего
3.7.2.Изучение влияния новых синтезированных соединений на внутриклеточное развитие хламидий
3.7.3. Оценка влияния отобранных низкомолекулярных соединений на
протеолитическую активность белка CPAF
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Sert““
Рис. 7. A. Пространственное выравнивание каталитических аминокислотных остатков (с распределением электронной плотности) трехмерной структуры CPAF, где красным отмечена молекула воды, акцептирующая протон водорода от гистина CPAF (Huang Z., et al., 2008). Б. Схема механизма катализа протеазы CPAF.
Таким образом, белок CPAF является сериновой протеиназой с водоопосредованной каталитической триадой, в состав которой входят остатки His 105, Ser499 и Glu558, а активная форма белка является гомодимером.
И хотя CPAF имеет достаточное количество протеолитических мишеней среди молекул хозяина, механизмы, лежащие в основе активации и катализа белка до сих пор не известны.
Как известно, многие эффекторные белки хламидий секретируются через ТТСС, которая осуществляет транспорт эффекторных молекул в один этап, из бактериальной клетки в цитозоль эукариотической клетки (Betts H. J., Wolf K., et al., 2009; Spaeth K. E., Chen Y. S., et al., 2009). Однако протеасомный белок CPAF секретируется через II систему секреции (Sec-зависимый путь), для которой характерно двухфазная секреция эффекторных молекул. Первый этап связан с экспортом белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму посредством специфической Sec-системы (SecYEG комплекса). Второй этап включает «созревание» белков и секрецию их через внешнюю мембрану в
1.5.3. Секреция белка CPAF через Sec - зависимый путь