Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа

• Автор: Лотош, Наталья Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Оглавление
Сокращения и термины
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. Введение
2. Сахарный диабет I-го типа: причины возникновения и иммунологические аспекты развития
2.1. Экспериментальные модели для исследования СД
2.1.1. Токсический диабет
2.1.2. Спонтанный диабет
2.2. Стадии развития диабета l-ro типа
2.2.1. Инсулиты
2.2.2. Медиаторы воспаления
2.2.3. Аутоантитела при диабете l-ro типа
2.3. Диагностика сахарного диабета 1-го типа
2.4. Дистальная полинейропатия
2.5. Нейрональные антитела при СД
3. Структура и функции человеческого сывороточного альбумина (ЧСА)
3.1. Окислительно-восстановительное состояние альбумина
3.2. Гликированис альбумина
3.2.1. Ранние продукты гликирования
3.2.2. Конечные продукты гликирования
3.3. Гликирование белков плазмы крови
3.3.1. Фибриноген
3.3.2. Коллаген
3.3.3. IgG
3.4. Методы определения гликироваиного альбумина
3.5. Исследование гликироваиного альбумина
3.5.1. Влияние гликирования и окисления на структуру и свойства
альбумина
3.5.2. Исследование сайтов связывания с глюкозой
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Исследование альбумина in vitro и в сыворотке крови
2. Формирование групп пациентов с диагнозом СД
3. Определение проинсулина в сыворотке крови детей с СД
4. Электромиографическое исследование (ЭМГ)
5. Определение аутоантител к нейрональным белкам в сыворотке детей с СД
6. Экспериментальная модель диабета (СТЗ-крысы)
7. Статистическая обработка данных

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Содержание проинсулина у детей с диабетом 1-го типа
2. Исследование гликироваиного альбумина in vitro
2.1. Окислительное гликирование альбумина in vitro
2.1.1. Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп в молекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентраций глюкозы
2.1.2. Определение сайтов гликирования в альбумине, предварительно гидролизированном трипсином, методами MALD1 -TOF и HPLC/MS/MS
2.1.3. Флуоресценция ЧСА и содержащегося в нём пентозидина
2.1.4. Анионообменная ВЭЖХ различных препаратов альбумина
2.2. Гликирование ЧСА в нефизиологических условиях
3. Определение гликироваиного альбумина в сыворотке крови
3.1. Подбор методик для выделения альбумина из сыворотки
3.2 Определение гликироваиного альбумина у детей с диабетом l-ro типа
4. Выявление дистальной полинейропатии у детей с диабетом 1 -го типа
5. Определение аутоантител к нейрональным белкам у детей с диабетом I -го типа
6. Определение нейрональных аутоантител у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
Список опубликованных научных работ по теме диссертации
БЛАГОДАРНОСТИ
ЛИТЕРАТУРА

Сокращения
ELIBA - enzymelinked boronatc immunoassay GAD - glutamic acid decarboxylase (декарбоксилаза глутаминовой кислоты)
IlbAIc - гликированный гемоглобин IIMA- human mercaptalbumin (человеческий меркаптоальбумин)
HNA1 - human nonmcrcaptalbumin 1 (человеческий немеркаптоальбумин 1)
IAA - insulin autoantibodies (аутоантитела к инсулину)
IA-2 - аутоантитела к тирозинфосфатазе ICA - islet cell antibodies (аутоантитела к островковым клеткам)
LC/iVIS - liquid chromatography/ mass spectrometry (жидкостная хроматография/масс-спсктрометрия)
MALDI-TOF - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight (времяпролетная матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация)
МНС - major histocompatibility complex (главный комплекс гисюсовместимости)
MS - mass spectrometry (масе-спектрометрия) NOD - none-obese diabetic (диабетические мыши без ожирения)
m/z безразмерная величина, отношение массы и заряда иона
аАТ - аутоантитела
АПК - антигеипрезентирующие клетки ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГФКБ — глиальный фибриллярный кислый белок
ДНФГ-2,4 -дппитрофеннлгидразин
ДПН - дистальная полинейропатия
ДТТИ - дитиотриитол
ИЛ - интерлейкин
ИНФ-у - интерферон
ИФА - иммуиоферментный анализ
кпг- конечные продукты гликирования
ОБМ - основной белок миелина
ПААГ - полиакриламидный гель
ПНС - периферическая нервная система
ПЭГ - полиэтиленглиголь
СД1 - сахарный диабет первого типа
СД2 - сахарный диабет второго типа
СТЗ - стрептозотоцин
ТНС - тстразолий нитросиний
ТФУ - трифторуксусная кислота
ФНО - фактор некроза опухолей
ФРН - фактор роста нервов
цнс - центральная нервная система
ЧСА — человеческий сывороточный альбумин
ЭМГ - электромиография
Термины
Оксиальбумин — коммерческий ЧСА, в котором содержится 0,4 М SH-групп в 1 М белка (0,4 М/М); Меркаптоальбумин - коммерческий ЧСА, в котором SH-группы восстановлены до 0,7 М в 1 М белка (0,7 М/М);
Супероксиальбумин - коммерческий ЧСА, в которм SH-группы окислены до 0,2 М в 1 М белка (0,2 М/М).

обсуждаемые результаты относятся к белку с большим количеством кетоамина, равном 5-12 М/М белка [102, 158, 172, 174] в то время как у людей, в норме и при диабете, этот показатель значительно ниже. Так, при выделении альбумина из сыворотки здоровых доноров с помощыо ПЭГ и определении кетоамина с помощыо ТНС были получены референсные значения 0,27-0,37 М кетоамина на 1 М белка, а у больных диабетом 0,5 - 0,8 М/М [136]. Следует отметить, что в литературе много данных по процентному содержанию гликированного альбумина у людей и крайне мало по молярным количествам кетоамина в альбумине.
При исследовании связывающих свойств альбумина было обнаружено изменение связывания с лекарствами в результате гликирования [172, 175, 176]. Причём было выяснено, что гликирование ЧСА ингибирует связывание лигандов с сайтом 11 и не влияет па связывание с сайтом I [177]. Отмечалось снижение сродства к билирубину на 50%, к свободным жирным кислотам — в 20 раз [104]. Немаловажную роль в снижении связывающих свойств гликированного альбумина играют аминокислот ные остатки, модифицированные глюкозой.
В то же время Yasukawa K. et al. показали, что ранняя стадия гликирования не влияет на связывающие свойства альбумина, в то время как снижение связывания встречается при дальнейшем гликировании [146]. Отношение HMA/HNA у пациентов с заболеваниями печени было смещено в сторону окисленной формы [86]. В работе Kawakami et al. окисление альбумина было проведено просто инкубацией при 37°С в аэробных условиях. Было отмечено уменьшение доли восстановленного альбумина с 70-80% до 55% [ 178].
В метаболизме NO важное место занимает формирование S-нитрозоальбумина. Поскольку концентрация SNO-alb в плазме крайне мала по сравнению с альбумином, эта модификация не должна влиять на функции альбумина.
Большинство исследований, посвященных способности альбумина в восстановленном и окисленном состоянии связывать различные лиганды, проводились in vitro. Использовались различные способы окисления белка: инкубирование с перекисью водорода, глюкозой, аскорбиновой кислотой в присутствии кислорода и ионов металлов, хлорамином Т, цистеином или гомоцистсином, N0. Индикаторами окисленного статуса служили: количество SH-rpynn, соотношение фракций НМА и HNA, количество карбонильных групп, формирование тирозиновых димеров, содержание фруктозоамииа, содержание S-нитрозо групп. Для определения связывания применяются различные методы, чаще всею вычисляется количество несвязавшихся с белком веществ. Изменение связывающих свойств альбумина вследствие воздействия различных агентов продемонстрированы в таблице 2.