Функциональные особенности эндогенных ретровирусов на примере gypsy (МДГ4)

• Автор: Сёмин, Борис Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 245 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2Л. Структурно-функциональная характеристика ретротранспозонов
2 Л Л. История открытия мобильных элементов
2Л.2. Многообразие ретротранспозонов
2Л.З. Открытые рамки считывания в
ретротранспозонах
2Л.4. Отсутствие рамок считывания в
ретротранспозонах
2Л .5. Стратегии распространения ретротранспозонов
2.1.6. Структурная организация ретротранспозонов.
2.1.7 Транскрипция и РНК ретротранспозонов
2.1.8. Перемещения ретротранспозонов с помощью
обратной транскрипции
2.1.5. Клеточный цикл репликации
2.2. Эрантивирусы
2.2.1. IERV-K и IERV-S подгруппы
2.2.2. Env эрантивирусов
2.2.3. Gag эрантивирусов
2.2.4. Вирусные частицы
2.2.5. Инфекционность эрантивирусов
2.2.6. Место эрантивирусов в филогении ретровирусов.
2.3. Взаимодействие ретровируса и клетки
2.3.1. Белки клетки, взаимодействующие с ретровирусной частицей
2.3.2. Экзосомная стратегия распространения вируса

2.4. Биотехнологичные вирусоподобные частицы
СОБЮСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Линии Drosophila melanogaster
3.2. Штаммы Escherihia coli, плазмиды и ферменты, использованные в работе
3.3. Маркеры размера и молекулярной массы
3.4. Праймеры
3.5. Манипуляции с нуклеиновыми кислотами
3.5.1. Выделение ДНК и РНК
3.5.2. Клонирование ДНК
3.5.3. Создание рекомбинантного бакуловируса
3.5.3. Конструирование плазмид для экспрессии в бактериях
3.6. Манипуляции с пересеваемыми культурами клеток
3.6.1. Трансформация культуры клеток
3.6.2. Совместное культивирование донорных и реципиентных клеток
3.6.4. Получение вирусоподобных частиц
3.6.5. Гибридизация in situ
3.7. Анализ нуклеиновых кислот и белков
3.7.1. Электрофорез образцов ДНК в агарозном геле
3.7.2. Блот анализ
3.7.3. Связывание меченой ДНК с белками, иммобилизованными на фильтре
3.7.4. РНК-белковое связывание
3.7.5. Вестерн-блот анализ
3.8. Бактериальная система экспрессии
3.8.1. Стандартные растворы
3.8.2. Среды

3.8.3. Добавки к средам
3.8.4. Синтез белка
3.8.5. Очистка белка
3.8.6. Концентрирование белков
3.8.7. Определение количества белка в пробе
3.8.8. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)
3.8.9. Выделение вирусоподобных частиц из бактериальных клеток
3.9. Электронная микроскопия
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Функциональные особенности вирусоподобных частиц (ВПЧ) на модели культивируемых клеток дрозофилы
4.1.1. Обнаружение вирусоподобных частиц
ретротранспозона ёУР$У в культуральных средах пересеваемых клеток
4.1.2. Способность вирусоподобных частиц,
образуемых gypsy, к межклеточной передаче этого мобильного элемента
4.1.2.1. Способность клеток D. hydei приобретать элемент gypsy при добавлении в среду их
культивирования внеклеточных вирусоподобных частиц
D.melanogaster
4.1.2.2. Способность gypsy перемещаться от донорных
к реципиентным клеткам в смешанной культуре
4.1.2.2. Увеличение во времени пропорции клеток D.
hydei, несущих gypsy
4.1.3. Способность ретранспозона МДГЗ перемещаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании

ретротранспозонов, что отражает специфичность работы интегразы элемента [Хесин, 1985]. Ретротранспозоны были обнаружены не только в составе геномной ДНК, но также и в виде экстрахромосомных копий, причем как линейных, так и кольцевых с одним ДКП и двумя [Flavell and Ish Horowicz, 1981; Flavell et al., 1981; Ilyin et al., 1984; Сёмин 1989].
Наиболее детально охарактеризованы кольцевые экстрахромосомные копии copia [Flavell and Ish Horowicz, 1981; Flavell and Ish Horowicz, 1983; Flavell, 1984].
2.1.7 Транскрипция и РНК ретротранспозонов
В результате транскрипции ретротранспозонов образуется полноразмерная РНК, служащая матрицей для образования белковых продуктов и для синтеза новых ДНК копий. Промотор для транскрипции ретротранспозонов располагается в ДКП, а далее (в теле) могут находиться дополнительные сигналы регуляции транскрипции. Наличие ДКП позволяет регенерировать в процессе обратной транскрипции функционально значимые последовательности, располагающиеся выше точки инициации транскрипции. Транскрипция ретротранспозонов обычно ведет к образованию полноразмерной РНК, обладающей всеми характерными чертами эукариотической мРНК: 5’ - «сар», 3’ - поли (А) и открытые рамки считывания, кодирующие белковые продукты [Arkhipova et al., 1995]. Как правило, ретротранспозоны не кодируют никакие собственные белковые факторы экспрессии, и полностью зависят от клеточных систем синтеза и процессинга РНК, трансляции и пострансляционной модификации белка
Эксперименты по влиянию а-аманитина на транскрипцию ретротранспозонов gypsy и jockey [Mizrokhi et al., 1988] в ядрах, выделенных из культуры клеток, показали, что синтез их РНК осуществляется РНК-полимеразой II [Smale et al., 1993]. Подавление а-аманитином работы