Инактивация фактора свертывания крови XIIA ингибитором трипсина из кукурузы

• Автор: Корнеева, Вера Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 84 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Сериновые протеазы. Механизм действия сериновых протеаз
1.2. Контактный путь активации свертывания
1.2.1. Активация фактора XII
1.2.2. Физиологическая роль фХП
1.2.3. Роль контактной активации в патологии
1.3. Ингибиторы контактной активации
1.3.1. Плазменные ингибиторы фХНа
1.3.2. Белковые ингибиторы фХНа неплазменного происхождения
1.3.3. Стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз
1.4. Ингибитор трипсина из кукурузы
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Используемые реактивы
2.2. Подбор праймеров, полимеразная цепная реакция и сайт-направленный мутагенез
2.3. Трансформация клеток штамма-продуцента плазмидными конструкциями
2.4. Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов
2.5. Очистка рекомбинантных ингибиторов
2.6. Измерение ингибирующей активности
2.7. Подготовка пространственных структур СНР1 и его мутантов для проведения докинга
2.8. Молекулярная динамика
2.9. Подготовка модельной структуры фактора ХИа на основе гомологии

2.10. Белок-белковый докинг
2.11. Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного СНЫ
3.2. Измерение ингибирующей активности
3.3. Моделирование взаимодействия протеаза-связывающей петли СНЫ с ингибируемыми протеазами
3.3.1. Подготовка пространственных структур СНЫ и его мутантов для проведения докинга
3.3.2. Моделирование структуры фХ11а. Докинг
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Благодарности
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение
Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических ферментов. К ним относят как эндо-, так и экзопептидазы, принадлежащие к различным семействам белков. Эти ферменты участвуют в различных процессах, таких как пищеварение, оплодотворения, активации комплемента, апоптоз, иммунный ответ и т.д. [1].
Плазменное звено свертывания крови также находится под управлением каскада сериновых протеаз, активирующих друг друга путем протеолитического расщепления. Плазменное свертывание может активироваться по двум путям: внешнему или пути тканевого фактора и внутреннему или контактному пути. Внешний путь активируется в результате попадания трансмембранного белка -тканевого фактора в кровоток в месте повреждения сосуда. Такая активация является физиологической и обеспечивает остановку кровотечений.
Активация плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII (фХП) при взаимодействии с отрицательно-заряженными поверхностями: in vivo - при контакте поверхностью
активированного тромбоцита или бактериальной клетки [2-4], внеклеточными нуклеиновыми кислотами и т.д., ex vivo - от контакта со стентами, катетерами и элементами сердечно-легочного шунтирования и in vitro - при заборе крови в результате контакта со стенками пластиковых и стеклянных пробирок [5,6].
Участие фХН в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясно, а его вклад в патологическое тромбообразование был показан экспериментально на животных моделях РеС13-индуцированного тромбоза [7], коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты [7,8] и острого ишемического инсульта [9].
Таким образом, активный фактор XII (фХІІа) представляет собой многообещающую мишень для создания новых антитромботических препаратов, т.к. подавление работы данного фактора не сказывается на поддержании

2.3. Трансформация клеток штамма-продуцента плазмидными конструкциями
Штамм-продуцент E. coli Rosetta-Gami 2 DE3 был использован для экспрессии рекомбинантных ингибиторов. Трансформацию проводили методом теплового шока [80] с незначительными модификациями. Химически компетентные клетки инкубировали на льду в течении 20 мин, затем в стерильных условиях к клеткам добавляли 5 мкл лигазной смеси, содержащей соответствующий экспрессионный вектор и инкубировали на льду 30 мин. Тепловой шок проводили в водяной бане при температуре 40 °С в течение 20 с. После теплового шока клетки немедленно переносили на лед. На следующем этапе каждую аликвоту клеток переносили в 0,5 мл питательной среды SOC. Инкубировали при 37 °С в течение 1 ч со встряхиванием на шейкере. Далее проводили селекцию трансформантов на твердой агаризованной среде, содержащей 25 мг/мл канамицина, в чашках Петри. Потенциальных продуценты отбирались по результатам пробной индукции в 4 мл питательной среды LB; экспрессию инициировали добавлением 1мМ ИГПГ. Наработку белка проводили в течение 2,5 ч при 37 °С.
Наличие вставки целевого гена у положительных трансформантов подтверждали секвенированием. В качестве сиквенсовых праймеров использовались, комплиментарные к вектору рЕТ28а, стандартные Т7 праймеры прямой
5’- TAATACGACTCACTATAGGG-3 ’ и обратный
5 ’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 ’.