Гомо- и гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока человека

• Автор: Мымриков, Евгений Викторович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
1. Обзор литературы
1.1. Семейство малых белков теплового шока
1.2. Структура малых белков теплового шока
1.3. Малые белки теплового шока человека
1.4. Некоторые функции малых белков теплового шока человека
1.4.1. Предотвращение агрегации денатурированных белков
1.4.2. Роль малых белков теплового шока в предотвращении апоптоза
1.4.3. Возможное влияние малых белков теплового шока на актиновый цитоскелет
1.5. Мутации малых белков теплового шока, коррелирующие с развитием наследственных заболеваний. Роль Р7-складки в структуре sHsp
1.6. Взаимодействие малых белков теплового шока человека
2. Цель и задачи исследования
3. Материалы и методы
3.1. Получение плазмид, содержащих кодирующие последовательности исследуемых белков
3.2. Тестовая и препаративная экспрессия рекомбинантных белков
3.3. Получение компетентных клеток E
3.4. Выделение и очистка рекомбинантных белков
3.4.1. Выделение и очистка HspB 1 дикого типа (HspBl WT)
3.4.2. Выделение и очистка HspB6 дикого типа (HspBöWT) и HspB6 с заменами C46S/E116С (HspBöCys)
3.4.3. HspB5 дикого типа (HspB5WT), выделение и очистка HspB5 с точечной мутацией El 17С (HspB5Cys)
3.4.4. Выделение и очистка HspB8 дикого типа (HspB8WT) и HspB8 с заменами С10S/C99S/N138С/С195S (HspB8Cys)
3.5. Сравнение структуры и шапероноподобой активности sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов

3.5.1. Получение восстановленных и окисленных белков
3.5.2. Сравнение вторичной структуры методом кругового дихроизма
3.5.3. Исследование третичной структуры методом собственной триптофановой
флуоресценции
3.5.4. Исследование гидрофобных свойств с помощью зонда bis-ANS
3.5.5. Сравнение олигомерного состояния методом гель-фильтрации
3.5.6. Измерение шапероноподобой активности малых белков теплового шока41
3.6. Формирование гетероолигомерных комплексов и анализ взаимодействия sHsp in vitro
3.6.1. Анализ взаимодействия различных малых белков теплового шока методом гель-фильтрации
3.6.2. Детекция гетероолигомеров методом аналитического
ультрацентрифугирования
3.7. Анализ взаимодействия малых белков теплового шока с помощью метода коиммунопреципитации in vitro и in vivo
3.7.1. Исследование взаимодействия sHsp человека на клеточном уровне
3.7.2. Метод вестерн-блоттинга
3.7.3. Получение моноклональных антител к HspB5 (аВ-кристаллину)
3.8. Аналитические методы
3.8.1. Электрофоретические методы
3.8.2. Определения концентрации белка
3.8.3. Окрашивание гелей серебром
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Выделение и очистка рекомбинантных малых белков теплового шока человека
4.1.1. Выделение и очистка HspBl дикого типа
4.1.2. Выделение и очистка «цистеинового» мутанта HspB5
4.1.3. Выделение и очистка HspBö дикого типа и его «цистеинового» мутанта
4.1.4. Выделение и очистка HspB8 дикого типа и его «цистеинового» мутанта
4.2. Сравнение структуры и шапсроноподобной активности sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов
4.2.1. Сравнение вторичной структуры sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов
4.2.2. Исследование третичной структуры белков методом собственной триптофановой флуоресценции
4.2.3. Исследование гидрофобных свойств малых белков теплового шока с помощью флуоресцентного зонда bis-ANS
4.2.4. Исследование олигомерного состояния методом гель-фильтрации
4.2.5. Измерение шапероподобной активности малых белков теплового шока
4.3. Исследование белок-белковых взаимодействий в гомоолигомерах sHsp человека
4.3.1. Сравнение структуры «цистеиновых» мутантов sHsp человека в восстановленном и окисленном состоянии
4.3.2. Сравнение шапероноподобной активности «цистеиновых» мутантов sHsp человека в восстановленном и окисленном состоянии
4.4. Формирование гетероолигомеров малых белков теплового шока человека
4.4.1. Образование гетсродимеров малыми белками теплового шока человека
4.4.2. Формирование гетсроолигомерных комплексов малых белков теплового шока дикого типа и их «цистеиновых» мутантов в условиях in vitro
4.5. Использование метода коиммунопреципитации для анализа взаимодействия малых белков теплового шока в условиях in vitro и in vivo
4.6. Исследование механизма взаимодействия малых белков теплового шока
4.7. Заключение
5. Выводы
6. Список цитированной литературы

поэтому несорбировавшиеся фракции объединяли и дальнейшую очистку осуществляли методами гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации.
Гидрофобную хроматографию проводили на колонке Phenyl HP HiTrap объемом 5 мл. Эту колонку уравновешивали буфером В (МЭ, pH 8,0), содержащим 0,ЗМ (N1-14)2804. К препарату белка, полученному после ионообменной хроматографии, добавляли сульфат аммония до концентрации 0,ЗМ и наносили на колонку. Промывали колонку 20 мл буфера уравновешивания, элюцию проводили градиентом сульфата аммония При этом сначала концентрация (N44)2804 в элюирующем буфере уменьшалась с 300 мМ до 15 мМ (объем этой части градиента 50 мл, 10 объемов колонки), а затем с 15 мМ до 0 мМ сульфата аммония (объем этой части градиента 50 мл). Скорость нанесения и элюции составляла 1,5 мл/мин. При проведении хроматографии собирали фракции объемом 1 мл и анализировали их белковый состав с помощью электрофореза по методу Лэммли [148]. Фракции, содержащие наибольшие количества HspBl, собирали и концентрировали с помощью ул ьтра ф и л ьтра ци и.
Следующим этапом очистки была [ель-фильтрация на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham Biosciences). Для этого полученный ранее препарат концентрировали до 8 мл и подвергали хроматографии на колонке, уравновешенной буфером В (МЭ), содержащим 150 мМ NaCI. Процедуру хроматографии проводили дважды, каждый раз нанося на колонку по 4 мл образца. Скорость элюции составляла 2 мл/мин. Фракции (по 3 мл), содержавшие высокоочищенный HspBl, объединяли. Полученный препарат концентрировали, диализовали в течение ночи против 2 л буфера В (20 мМ трис-ацетат, pH 7,6, 10 мМ NaCI, 0,1 мМ ЭДТА, 2,0 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ) и хранили при -20°С.
Для очистки всех остальных белков мы комбинировали первые стадии экстракции растворимых белков из суспензии культуры клеток E. coli и фракционирования сульфатом аммония с двумя стадиями хроматографической очистки (из трех описанных выше) (рис. 5). Условия проведения хроматографии были аналогичны условиям, описанным в данном разделе для HspBl дикого типа.