Особенности устройства цитохромоксидазы ba3 из термофильной бактерии Thermus thermophilus

• Автор: Калинович, Анастасия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Общая характеристика цитохромоксидазы. Митохондриальная
цитохромоксидаза типа а«з.
1.1. Общий план строения
1.2. Механизм функционирования цитохромоксидазы
1.3. Взаимодействие с лигандами
1.3.1. Взаимодействие окисленной митохондриальной оксидазы с 17 лигандами
1.3.2. Взаимодействие восстановленной митохондриальной оксидазы с 20 лигандами.
1.4. Классификация семейства гем-медных оксидаз
Глава 2. Цитохромоксидаза bai из T. thermophilus.
2.1. Общие свойства и особенности структуры оксидазы bai
2.2. Особенности функционирования оксидазы Ьа3.
2.3. Особенности взаимодействия с лигандами оксидазы Ъаъ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материалы
1.1. Реактивы и растворы.
1.2. Препараты ферментов
2. Методы исследования
2.1. Получение препарата рекомбинантной ЦО Ьа3 из T. thermophilus
2.2. Создание мутантной ЦО Ьа3 из T. thermophilus
2.3. Получение протеолипосом
2.4. Оптические измерения
2.5. Калориметрические измерения
2.6. Измерение активности фермента
2.7. Измерение генерации потенциала цитохромоксидазой bai на 42 протеолипосомах
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .
Г лава 1. Общие характеристики цитохромоксидазы bai из T. thermophilus

Глава 2. Особенности взаимодействия цитохромоксидазы Ля3 с лигандами
2.1. Взаимодействие окисленного гема я33+ цитохромоксидазы Ля3 с лигандами
2.2. Взаимодействие восстановленного гема я3 цитохромоксидазы йя3 с цианидом.
2.2.1. Спектральные свойства комплексов восстановленной цитохромоксидазы Ля3 с цианидом
2.2.2. Кинетика связывания цианида восстановленным гемом я32+ цитохромоксидазы Ля3.
2.2.3. Сродство восстановленного гема я32+ цитохромоксидазы Ьаъ к цианиду.
2.3. Два типа комплекса восстановленной цитохромоксидазы Ля3 с окисью углерода
Глава 3. Гемосопряженные ионизируемые группы цитохромоксидазы Ля
3.1. pH-зависимость спектров поглощения.
3.2. pH-зависимость скорости связывания цианида восстановленной цитохромоксидазой Ьа
Глава 4. Особенности мутантной формы оксидазы Ля3 по кислородному каналу
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
MOPS - 3-[Ы-морфолино]пропансульфоновая кислота
HEPES -4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота
Tris — трис(гидроксиметил)-аминометан
ДрН+-трансмембранная разность электрохимических потенциалов иона водорода Л|/ - трансмембранная разность электрических потенциалов
ДАД - диаминодурол
ДМ — додецил-(і-0-мальтозид
Кд - константа диссоциации
КД - круговой дихроизм
МКД - магнитный круговой дихроизм
НАДН — никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НОР - NO-редуктаза
ПЦР — полимеразно-цепная реакция
ТМФД-N, N, М'фТ-тетраметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид
ФМС — феназинметасульфат
ХЦКФ - м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон
ЦО - цитохромоксидаза
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ТЬегтяІ
Рікласіїятсаі
(1) СО(зо1), НЬ-Гс, Сив

34.5 ґ
(2) Hls.Fe.CO, Си„ Нії-Ге, Сед-СО
(5) [НЬ-Ге]*, Си^СО

к3 - 28 6 ігі к.2= 0 3 я-
(4) СО*, [НвРе]*, Счв
(3) HiS.Fe.CO, Си„
Ы (532 ш)

Сотріех В
Рис. 6. Схема динамики связывании и рекомбинации СО с цитохромоксидазой
Ьаз. Из работы [4].
Схема применима и для митохондриальной ЦО аа^, кроме скоростей связывания СО в левой части схемы и состояния (2) - у митохондриальной оксидазы во всей популяции фермента СО связан с гемом аз {Нія-Рс—СО, Сив}. Также состояние (5) для
митохондриальной ЦО ааз идентично комплексу А, в отличие от ЦО Ьаз.
Данных о взаимодействии с цианидом немного.
Спектрально были исследованы следующие аддукты цианидного комплекса ЦО Ьа}: восстановленного одним электроном, находящимся на геме а3, тремя электронами (медь Сив окислена) и четырьмя электронами (полностью восстановленный фермент) [87]. Между этими цианидными комплексами были отмечены лишь незначительные спектральные изменения: при последовательном восстановлении максимум поглощения комплекса а32+— СИ (при ~590 нм) смещался на 1 нм в длинноволновую область [87, 94], на рамановских спектрах отличий обнаружено не было [98]. Авторы делают вывод о том, что восстановление трех других редокс-центров не влияет на прочность связи гема «з2+ с цианидом.
Имеются данные (без количественных оценок) о высоком сродстве к цианиду частично восстановленной оксидазы Ьаз [94]. Авторы предполагают, что цианид наиболее легко связывается с биядерным центром в состоянии смешанной валентности а32+ Сив2+, которое реализуется в присутствии таких восстановителей, как ферроцианид или аскорбат в аэробных условиях, а также имеет место в каталитическом цикле (одноэлектронный интермедиат Е).