Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус-фактора и диагностики синдрома Дауна у плода

• Автор: Благодатских, Екатерина Григорьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Цели и задачи работы
Научная новизна работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕИНВАЗИВНАЯ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА
Плацента. Строение и функции
Попытки и методы неинвазивной диап юстики
Клетки плода
Эригробласты
Трофобласты
Циркулирующие нуклеиновые кислоты
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
Общие сведения
ПЦР в реальном времени
Анализ линейных разрушаемых проб (ТаоМаи® анализ)
ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ
Одностадийная ОТ-ПЦР
Двухстадийная ОТ-ПЦР
Цифровая ПЦР
ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ
Мини- и микросателлиты
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)
Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП)

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА СЦЕПЛЕННЫХ С ПОЛОМ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Гемофилия типов А и В
Синдром Мартина-Белл
Дистрофия Дюшенна
Методы пренатальной диагностики пола плода
ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА
Отрицательный резус-фактор. Клинические аспекты
Гены группы Ын
ПРИМЕНЕНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА
Синдром Дауна. Клинические, генетические и социальные аспекты
Внеклеточные плодные нуклеиновые кислоты в диагностике синдрома
Дауна. Попытки, подходы и методы
Плацентарные мРНК. Попытки и методы. Выбор исследуемых генов и маркеров
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы крови и плазмы крови
Выделение геномной ДНК человека методом фенол-хлороформной
экстракции
Выделение циркулирующей ДНК из плазмы
Выделение циркулирующей РНК из плазмы
Обратная транскрипция
Параметры и компоненты ПЦР в реальном времени, а также ПТ]Р и ОТ-

Пороговый цикл
Олигонуклеотиды

УСЛОВИЯ ПЦР И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ
Цифровая ПЦР
Оценка эффективности проведения ПЦР
Генотипирование полиморфных маркеров rs8130833, rsl 155158 и rs7354
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА ПЛОДА
Цифровая ПЦР
Амплификация участков ДНК, содержащих маркер DYS14 с целыо определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин
ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА
Определение предела обнаружеі іия участков гена RHD в реакционной
смеси
Установление резус-фактора плода по образцам плазмы крови беременных женщин
РАЗРАБОТКА ПОДХОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА У ПЛОДА ПО ОБРАЗЦАМ ПЛАЗМЫ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН
Определение количества и качества выделенной РЖ
Исследование сохранности РНК в крови и плазме крови
Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мРНК
Идентификация генетических маркеров, пригодных для проведения
исследования
Генотипирование полиморфных маркеров в генах PLAC4, c21orf105 и DNMT3L
ВЫВОДЫ

хромосомы 21, число положительных лунок для хромосомы 21 должно быть больше. Степень различия зависит от фракциональной концентрации ДНК плода в образце. Например, при анализе плацентарной ДНК, теоретическое отношение количества материала сравниваемых хромосом в геноме плода должно быть 3:2, т.е., разница составляет 1,5 раза. Однако, как описано ранее, теоретическое отношение уменьшается до 1,05 при анализе образца материнской плазмы, содержащего 10% ДНК плода. В случае если полученные данные были неклассифицируемы, проводился дополнительный анализ одной или более 3 84-хлуночных планшетов.
Ло и соавторы показали, что для образца, состоящего из 25% ДНК плацентарного происхождения и 75% ДНК материнских клеток крови, цифровая ПЦР позволяет корректно определять анеуплоидию по хромосоме 21 в 97% случаев при условии, что как минимум 7680 молекул ДНК доступны для анализа. Таким образом, Ло и его коллеги предоставили набор параметров, документально подтверждающих статистическое отношение между фракционной концентрацией нуклеиновых кислот плода, числом молекул нуклеиновых кислот и частотами корректной классификации анеуплоидии.
Для исследователей, работающих над технологиями увеличения концентрации ДНК плода, эти параметры пригодятся для управления степенью необходимого обогащения ДНК плода. Для исследователей, применяющих эпигенетические [65, 66] или мРНК маркеры [42]
представленные данные отразят число специфичных для плода молекул эпигенетических или мРНК маркеров, необходимых для уверенного диагноза. С развитием высокочувствительных методов для проведения анализа цифровой ПЦР, например, капиллярная ПЦР [67] и эмульсионная ПЦР [68], ожидаемо, что эта технология, будет иметь влияние на клиническое применение в неинвазивной пренатальной диагностики в ближайшем будущем.